Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Summary

Bu protokol, ardından hızlı bir şekilde tüm hücre algılama, domates ve diğer taze ürün yüzeyler örnekleme için basit bir yapışkan bant tabanlı yaklaşım, açıklar<em> Salmonella</em> Floresan kullanarak<em> In situ</em> Hibridizasyon (FISH).

Abstract

Bu protokol, domates ve diğer taze ürün yüzeyleri yapışkan bant tabanlı örnekleme bant floresan in situ hibridizasyon (FISH) Salmonella spp hızlı kültür-bağımsız tespiti için takip için basit bir yaklaşım açıklanmıştır . Hücre ücret bantları da algılama önce katı faz zenginleştirme için seçici agar yüzü aşağı yerleştirilmiş olabilir. Alternatif olarak, düşük hacimli sıvı zenginleşmesi (sıvı yüzey miniculture), akım sitometri analizi ile FISH ve non-selektif suyu bant yüzeyi, yapılabilir. Başlamak için, steril yapışkan bant, taze ürün ile temas getirilen hafif basınç uygulanır ve bant fiziksel olarak bu yüzeyler üzerinde bulunan mikropların açılan kaldırılır. Bantlar cam mikroskop lamı üzerine yapışkan yüzü yukarı monte edilip edilmediğini ve örneklenen hücrelerin% 10 formalin (30 dk) ve kurutulmuş kademeli etanol serisi (50, 80, ve% 95; 3 dakika Her konsantrasyon) ile sabittir. Sonra, hücre ücret bantları Salmonella hedefli DNA prob kokteyl içeren tampon ile tespit ve 15 melezleşmiştir – 55 30 dk ° C, kısa bir bağlanmamış prob kaldırmak için bir çamaşır tamponunda durulama takip. BALIK-etiketli hücreleri, yapışkan sonra floresan mikroskopi kullanılarak izlenebilir boya 4 DNA ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ve sonuçları ile zıt olan. Katı faz zenginleşmesi için uygun bir seçici agar yüzeyinde, hücre ücret bantlar yüzü aşağı yerleştirilir ve yukarıda açıklandığı gibi, FISH ve mikroskopi takip Salmonella mikrokoloniler yerinde büyüme izin inkübe . Sıvı yüzey miniculture için, hücre ücret bantlar yapışkan tarafına yerleştirilir ve silikon perfüzyon odasının uygulanır, böylece bant ve mikroskop lamı formu, su geçirmez bir odasına alt Triptikaz Soya küçük bir hacmi (≤ 500 mcL) Broth (TSB) tanıtıldı. Giriş çıkış portları kapalı ve odaların 35 inkübe – 37 ° C, teyp çıkarılan mikropların büyüme tabanlı amplifikasyon sağlar. Inkübasyon sonrasında, giriş portları kaplanmadan, hücreler müstakil ve karışık kuvvetli geri ve ileri pipetleme, santrifüj yoluyla hasat ve% 10 oranında sabit nötr tamponlu formalin. Son olarak, örnekler melezleşmiştir ve Salmonella spp varlığını ortaya çıkarmak için akım sitometri yöntemiyle incelenir . Burada açıklandığı gibi, "tape-FISH" yaklaşımı domates yüzeylerde, basit ve hızlı bir örnekleme ve Salmonella algılama sağlayabilir. Ayrıca, ıspanak ve jalapeño biber taze ürünler de dahil olmak üzere diğer türleri, örnekleme için bu yaklaşım kullandık.

Protocol

1. Steril Yapıştırıcı Bant Yüzey Örnekleme

1. Örnekleme için kullanmak üzere bir bant seçin. Piyasada bulunan Mantarlar-teyp veya Con-Tact örnekleme bantları kullanım kolaylığı için steril ve özel paketlenmiş. Ancak, şeffaf (optik açık) genel ofis bant da kullanılabilir olması bulduk.
2. , Yapışkan bant, 10 cm parça (bir kağıt şablonu kullanılabilir) yapışkan olmayan bir tarafında ^{1 cm} 2 kare çizmek için kalıcı bir kalem kullanın. Bu bant kısmı gıda veya çevresel bir yüzeye örnek edildiği kaydetti için görsel bir kılavuz olarak görev yapacak.
3. Numune alınacak yüzeyine bakacak şekilde yapışkan tarafı ile "C" şeklindeki bant döngü oluşturur. Bunu yapmak için, arka (yapışkan olmayan tarafı) bant (Şekil 1) çizilmiş kare karşı başparmak, orta parmak ve pozisyon işaret parmağı ile yapışkan uçları tutun.
4. Numune alınacak yüzeyinde bant yerleştirin ve yavaşça yüzeye karşı işaretli alana basın. Bant kenarları bırakmadan, yapışkan bant yan kabarcıkları kaçınarak, numune yüzeyine tam olarak temas gelir sağlamak için parmağı kullanın.
5. Hatta bir hareket kullanarak, yavaş yavaş, fiziksel olarak yüzey bağlı mikropların açılan örnek uzak bant çekin. Cam bir mikroskop lamı üzerine, genel şeffaf ofis bant kullanarak, hücre ücret bant, yapışkan tarafı sabitleyin. Düz olmayan wrinkly bir yüzey oluşturulur, böylece bant düzgün gerginlik / germe olun. Bu bant hibridizasyon sırasında sonraki ısıtma sırasında deformasyon / kıvrık ile ilgili sorunları en aza indirmeye yardımcı olacaktır.

2. Katı-faz Zenginleştirme ve Sıvı Yüzey Miniculture

1. Katı-faz zenginleştirme örneklenen hücrelerin agar yüzeyi ile doğrudan temas halinde yerleştirilir böylece Xylose Tergitol-lizin-4 (XLT-4) agar plaklarına yüzü aşağı bant yerleştirerek yapılır. Bant şablonu / örnek temas kısmı ile aynı hizada agar yüzeyi ve bandın bir ucunu gevşek zenginleştirme aşağıdaki agar yüzeyine bandı kolay çıkarılmasını kolaylaştırmak için Petri kabı yan duvarına yapıştırılır yerleştirilir.
2. Tabaklar ters (yoğunlaşma önlemek için) ve 35 inkübe – 37 ° C Salmonella spp yeterli büyüme izin verecek. Hücreleri tespit edilebilir bir seviyeye zenginleştirmek için gereken kuluçka süresinin uzunluğu ilk Salmonella kirlilik düzeylerine bağlıdır. Biz, 8 saat zenginleştirme sonra, düşük başlangıç ​​inocula mükemmel microcolony oluşumu gözlenen var.
3. İstenen zenginleştirme döneminden sonra, agar plaka açın. İnkübasyon sırasında bant yapışkanlık koruyacaktır. Agar-agar bant arayüzü oluşan mikrokoloniler maksimum iyileşme sağlamak için işaret parmağını kullanarak karşı bant hafifçe basın. Petri kabı duvara bağlı kenar bandı tutun ve yavaş bir hareket bile, onu kaldırmak. Yukarıdaki bölüm 1.5 'de açıklandığı gibi hücre ücret bant, yapışkan tarafı, bir mikroskop lamı üzerine monte edin. Aşağıda yer alan "Fiksasyon ve Dehidratasyon" adımı geçin.
4. Sıvı yüzey miniculture için, yukarıdaki bölüm 1.5 'te açıklandığı gibi, bir mikroskop lamı üzerine numune almak için kullanılan bant bağlayarak başlar. Sonra, oluşturan alt yukarı bakacak şekilde, hücre ücret bant oluşur yalıtılmış bir bölmede steril olmayan bir silikon perfüzyon odası (Coverwell, Grace Bio-Labs, Inc.) Bant şablonu / numune temas kısmı, kapsar. Sıkıca, ama nazikçe yerleştirin, su geçirmez bir mühür sağlamak için odasına basın.
5. Pipet, transferi ≤ 500 mcL Triptikaz Soya Broth ya da odasının küçük giriş limanlarından biri aracılığıyla diğer uygun zenginleştirme orta yükleme esnek bir jel kullanılması. 35 -37 buharlaşma ve inkübe slaytlar önlemek için, şeffaf ofis bant ile iki port Seal ° C yeterli zenginleştirme için gerekli gibi. Iyi bir numune alma ve işleme uygulamalarına göre tüm işlemler yapılmalıdır rağmen, port sızdırmazlık bandı veya perfüzyon odaları sterilite sıvı yüzey miniculture sırasında gerekli değildir. FISH ve flow sitometri kombinasyonu Salmonella spp açık bir ayrımcılık sağlayacaktır. hedef dışı bakterilerden örnek kendisinden gelmesi bekleniyor hedef olmayan flora en büyük katkı, mevcut olabilir. Aşağıda yer alan "Fiksasyon ve Dehidratasyon" adımı geçin.

3. Fiksasyon ve Dehidrasyon

1. , Doğrudan yüzey örnekleme için veya katı faz zenginleşmesi için Salmonella spp . XLT-4 agar-teyp hücre fiksasyonu gerçekleştirmek az 30 dakika süreyle 25 ° C 500 mcL% 10 nötr ile örnek bir iletişim alanı kapsayan formalin solüsyonu.
2. Fiksatif yapışmalı, bir konteyner (toksik / tahriş edici buhar maruz kalma en aza indirmek için bir kimyasal kaputu altında) içine atın.
3. Etanol serisi (300 mcL / 3 dak Her konsantrasyon% 50,% 80 ve% 95) dehydrate. Aşağıda yer alan "hibridizasyon" adım devam edin.
4. 500 mcL sıvı yüzey miniculture örnek tespit içinlar, kaplanmadan perfüzyon odaları, ve esnek bir jel yükleme pipet enrichate ayıklamak için kullanılır. Aşağı yukarı hızlı ve pipetleme kalan herhangi bir bant bağlı hücreleri etkili bir şekilde çıkarılması sağlamak amacıyla kullanılacaktır.
5. Sonra, tüm 500 mcL miniculture hacmi mikrosantrifüj tüpüne transfer ve 2.000 xg (5 dk) aşağı döndü. Süpernatant atılır, pelet sonra% 10 eşit hacmi yeniden süspanse, 30-60 s için şiddetle vortekslenmiş olan nötr tamponlu formalin. Hücreler 30 dakika 25 ° C sabit
6. Sonra, fiksatif kaldırılır ve örnek hücre saklama tampon yeniden süspanse aşağıdaki gibidir. 60 s,% 50 denatüre etanol-% 50 eşit hacmi yeniden süspanse fosfat-numune 2.000 xg (5 dk, 25 ° C) süpernatantı atılır, pelet 30 şiddetle vortekslenmiş. Eğirilir tamponlu salin. Sabit hücreler, -20 ° C'de (yıl) süresiz olarak saklanabilir Not: sıvılar (örneğin, fiksatif veya farklı tampon tanıtan) değiştirilir zaman, iyice (vorteks) en az bir kısmında hücre pelet (~ 10 – 20 mcL) tekrar süspansiyon için önemlidir "giden" sıvı sistemi . Bu topaklanma önlemek ve tek tek hücreler bile süspansiyonları elde edilir olmasını sağlamak yardımcı olacaktır. Aşağıda yer alan "hibridizasyon" adım devam edin.

4. Melezleme

1. Hibridizasyon / yıkama tampon ticari moleküler biyoloji dereceli çözümler Malzeme Tablo kaydetti kullanarak hazırlayın. Final tampon bileşeni konsantrasyonları 0,7 M NaCl, 0.1 M TRIS [pH 8.0, 10 mM EDTA,% 0.1 sodyum dodesil sülfat, 0.22 mikron bir şırınga ya da fincan filtre kullanarak molekül sınıfı su ve süzülür son İstenen hacme kadar yapılan. Sondalar (aşağıya bakın) ilavesi olmadan aynı tampon, bir çamaşır tampon olarak kullanılır. Onceden hibridizasyon ve tamponlar yıkama ile 55 ° C
2. Floresan etiketli ekle Sal3 (Nordentoft ve ark, 1997; 5'-AAT CAC TTC ACC TAC GTG-3 ') ve Salm-63 (Kutter ve ark, 2006; 5'-TCG ACT GAC TTC AGC TTK-3' Önceden ısıtılmış hibridizasyon tamponu) oligonükleotid problar (Malzeme Tablo). Toplam prob konsantrasyonu 5 ng mcL ^-1 (Bisha ve Brehm-Stecher, 2009a 2.5 ng mcL ^-1 her sonda) kullanılır.
3. Doğrudan-kaset ve katı faz zenginleştirme örnekleri için, prob kokteyl içeren hibridizasyon tamponu 300 mcL bant şablonu örnek temas alanı kaplaması ve 55 ° C'ye kadar nemli, kapalı kuluçka odasında bant bağlı hücrelerin melezleşme Slayt Moat aleti (Malzeme Tablosu) gibi bir doğrudan temas inkübatör kullanılması durumunda, örnekler 15 dakika süreyle melezleşmiştir ve> 20 slayt aynı anda işlenebilir. Bambino aleti (Malzeme Tablosu) gibi, bir döner tarzı hibridizasyon fırın kullanılması durumunda, slaytlar hibridizasyon için 50 ml polipropilen santrifüj tüpleri, tüp başına bir slayt yerleştirilir. Isı transferi doğrudan olduğundan, bu örnekleri daha uzun süre (30 dakika kadar) için melezleşmiştir.
4. Hibridizasyon, slaytlar kaldırılır ve prob içeren hibridizasyon tampon kaplaması atılır. Slaytlar sonra önceden ısıtılmış yıkama tampon kaplaması ya (30 dakika kadar) ya da kısa ve hafifçe eğik bir slayt (300 mcL her 3 durular) üzerinde küçük bir tampon hacmi pipetleme tarafından önceden ısıtılmış yıkama tamponu ile durulanır, ya da resmi yıkanır Önceden ısıtılmış yıkama tamponu içeren 50 ml polipropilen santrifüj tüpüne daldırma. Deneyimlerimize göre, resmi bir yıkama gelişmiş sonuçları (bağlanmamış prob daha az bulanıklık) sağlayacak olsa da, basit bir durulama Salmonella spp net tespiti için yeterli olmaktadır. Sonra, slaytlar, aşağıdaki "Algılama" adıma geçmeden önce hava kuru.
5. Sıvı yüzey miniculture örnekleri Hibritleşme pelet vorteks ve dinç içeren 100 mcL önceden ısıtılmış hibridizasyon tamponu tabanda takip 2.000 xg'de 5 dakika (taze -20 ° C'de sabit veya depolama tamponda tutulan) numuneler iplik tarafından yapılır prob kokteyl. Örnekler 55 melezleşmiştir ° C 500 mcL önceden ısıtılmış yıkama tampon ilave edilerek takip eden bir ısı blok veya diğer uygun inkübasyon istasyonu (Malzeme Masa), 30 dk. Bant bağlı örnekler olduğu gibi, bu örnekler resmen için yıkanmış olabilir daha fazla inkübasyon 30 dakika 55 ° C yıkama tamponu, aralıklı vorteks bu. Alternatif olarak, numunelerin iyice analiz için hemen hasat (aşağıda) takiben, 500 mcL önceden ısıtılmış yıkama tampon eklenmesinden sonra vortekslenmiş olabilir.
6. Salmonella tespiti için hazırlık. flow sitometri ile, sıvı yüzey miniculture örnekleri 5 dakika boyunca 2.000 xg aşağı bükülmüş, süpernatantı atılır ve numuneler 300 mcL oda sıcaklığında yeniden süspanse (~ 25 ° C) PBS. Hibridizasyon ve analiz arasında bir gecikme beklenen ise, örnekleri uzak bir tesis taşıma ihtiyacınız varsa ya da numuneler önce ana buzdolabında veya buz üzerinde yapılan olabilirlizis. Alternatif olarak, numuneler hücre saklama tamponu (PBS ve mutlak etanol karışımı 50:50) transfer edilir ve kayda değer kayıpları olmadan bir hafta kadar -20 ° C'de tutulan olabilir prob-haiz floresan (Bisha ve Brehm-Stecher, 2009b) .

5. Bulma

1. Salmonella spp-teyp tespiti için. floresan mikroskobu ile doğrudan-kaset ya da katı faz zenginleştirme örnekleri nükleer counterstain içeren 4 ~ 10 mcL Vectashield H-1200 montaj orta ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), bir kapak kayma ile monte, yerleştirilmiştir. sonra 10 dakika süreyle karanlıkta inkübe edildi.
2. Daldırma yağ kapağı astar üzerine yerleştirilir, ve örnekleri, yüksek büyütmeli yağ objektif (63x veya 100x) kullanılarak incelenir. DAPI filtre örnek odak noktası haline getirmek için kullanılır, mikroskop, daha sonra uygun filtre (yeşil ya da kırmızı, son-etiket probları için kullanılan boya bağlı olarak) ve Salmonella hücreleri açıldığında (floresans göre görsel gol Rakamlar 2 ve 3).
3. Sıvı yüzey miniculture örnekleri sitometrik tespiti için yerel olanaklara bağlı olarak, çeşitli aletler kullanılır. PBS-askıya örnekleri laboratuvarda, 5 ml yuvarlak alt örnekleme tüpleri (BD Falcon) aktarılır ve 647 nm (Malzeme Tablo) uyarma ile bir FACSCanto akış sitometresi kullanılarak incelenir. Yüksek sayılarda toplam bakteri içeren zenginleştirilmiş örnekleri için, "düşük akış hızı" ayarı (10 mcL min ^-1) kullanılır ve 5,000-50,000 olaylar toplanır. Veri FlowJo yazılımı (sürüm 8.8.6, Tree Star, Inc, Ashland, OR) veya başka uygun bir analiz yazılımı (Şekil 4, A ve B panelleri) kullanılarak analiz edilmektedir.

6. Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 1. Salmonella spp örnekleme için yapışkan bant kullanın. yapay olarak kontamine domates yüzeyinden.

Şekil 2. Tipik bir domates (100 X yağ objektif) yüzeyinden doğrudan-kaset örnekleme ve Salmonella Typhimurium ATCC 14028 BALIK algılama sonuçlar Texas iki prob kokteyl Kırmızı etiketli sondalar (Sal3/Salm-63) kullanılır. bu hücrelerin etiket.

Şekil 3. Salmonella Typhimurium ATCC 14028 mikrokoloniler 37 8 saat on-bant zenginleştirme ° C sonra ilk inokulum yapay olarak kontamine domates yüzeyinden örnekleri alındı ​​ksiloz Lizin Tergitol-4 (XLT-4) agar yüzeyinde oluşmuş. Katı-faz zenginleştirme tespiti için kullanılabilir hücre sayısını artırır ve aynı zamanda hücresel rRNA içeriğini arttırır.

Şekil 4. S. örnekleme için yapışkan bant kullanın enterica serovar Typhimurium FISH ve akım sitometri (panel A) aracılığıyla veya doğrudan analizi ile 500 mcL Triptikaz Soy Broth (panel B ile dolu bir perfüzyon odasında 5 saat non-selektif sıvı yüzey miniculture zenginleştirme sonra yapay olarak kontamine domates, yüzeyden .)

Discussion

Basit ve hızlı yöntemler üretmek yüzeylerin patojenlerin saptanması için zamanında ve aksiyona yönelik veri sağlayan gıda kaynaklı hastalık azaltılmasına yardımcı olabilir. 1950'lerden beri, çevre klinik ve gıda mikrobiyolojisi Yapıştırıcı bant tabanlı örnekleme yöntemleri kullanılabilir ve direkt mikroskobik inceleme ya da için sağlam bir medya yapışık mikroorganizmalar transferi, mikroorganizmaların giderilmesi için yüzeylere "Scotch" tarzı kaset basarak dahil edilmiştir var büyüme (Barnetson ve Milne, 1973; Edwards ve Hartman, 1952; Evancho ve ark, 2001; Fung ve ark, 1980; Lakshmanan & Schaffner, 2005; Langvad, 1980). Taş anıtlar (La Cono & C. URZI, 2003) yüzeylerde kolonize mikroorganizmaların kültür-bağımsız bir analiz için yeni bir değişiklik, bant tabanlı örnekleme floresan in situ hibridizasyon (FISH) kombinasyonu nitelendirdi. Biz hızlı örnekleme ve taze ürünler, domates, ıspanak ve Jalapeno biber (Bisha ve Brehm-Stecher, 2009a) de dahil olmak üzere mevcut Salmonella tespiti için benzer bir yaklaşım uyguladık. Yapışkan bant FISH işlenmiş ve floresan mikroskobu ile görülebilir ve bu gıdalar örneklerinden hücreleri çıkarmak için kullanılabilir. 2 saat bu şekilde, en az ³ 10 CFU cm ^-2 Salmonella (mikroskopi tabanlı yöntemleri için tespit sınırı) ~ 1.5 içinde taze ürün tespit edilebilir Alternatif olarak, kısa (8 saat) katı faz zenginleşmesi seçici agar hücre ücret bant yüzü aşağı koyarak ve ortaya çıkan mikrokoloniler FISH ile tespit edilebilir. ≤ 500 mcL sıvı ortamları ile kaset kaplanacağı, bant-örneklenmiş Salmonella hücreleri (Şekil 4, panel A) flow sitometri kullanılarak FISH sonra ayrılmış ve doğrudan tespit edilebilir. BALIK sonra hedef ve hedef dışı hücreleri (Şekil 4, panel B) karmaşık bir karışım kolayca tespit Salmonella hücreleri ile bu non-selektif sıvı minicultures Kısa inkübasyon (~ 5 saat), bakteriler önemli bir zenginlik sağlar . Toplu sonuçlar çıkarma, sunum ve domates ve diğer taze ürün mevcut özel bakterilerin tanımlanması için yeni bir yöntem bu yaklaşım sağladığını göstermektedir. Biz, burada DNA tabanlı probları kullanımını tarif olmasına rağmen, bu yaklaşım aynı zamanda, Salmonella-spesifik problar da tarif edildiği gibi peptid nükleik asitler (PNAS'ta) gibi alternatif prob kimyaları, (Almeida kapsayacak şekilde genişletildi olabileceği muhtemeldir ve ark, 2010).

Materials

Fungi-Tape sampling tape	Scientific Device Laboratory	745	http://www.scientificdevice.com/
Con-Tact-It sampling tape	Birko Corporation, Denver, CO		http://www.birkocorp.com/
Clear office tape, generic	Various		Should be optically clear, have low intrinsic fluorescence
Food surface	Local Grocery Store		Tomat–s (red tomat–s on the vine, not waxed or oiled) used here
Trypticase Soy Broth	Difco Laboratories	211768	For non-selective liquid surface miniculture enrichment
Xylose-lysine-Tergitol 4 agar base	Difco Laboratories	223420	For <em>Salmonella</em>-selective agar (XLT-4)
Xylose-lysine-Tergitol 4 agar supplement	Difco Laboratories	235310	For<em> Salmonella</em>-selective agar (XLT-4)
Formalin solution	Sigma-Aldrich	HT5011	10% solution, neutral, buffered (cell fixative)
Absolute ethanol	Sigma-Aldrich	E7023	Molecular biology grade (pre-hybridization dehydration)
1.5 ml microcentrifuge tubes	Various		RNase- and DNase-free
Microscope slides and cover slips	Thermo Fisher Scientific, Inc.
NaCl solution	Sigma-Aldrich	S5150	Molecular biology grade, 5M solution (hybridization buffer component)
Tris-EDTA buffer solution (100X concentrate)	Sigma-Aldrich	T9285	1M Tris [pH 8.0], 0.1M EDTA (hybridization buffer component)
Sodium dodecyl sulfate solution	Sigma-Aldrich	L4522	10% solution in 18 megohm water (hybridization buffer component)
Sal3 and Salm-63 oligonucleotide probes	Integrated DNA Technologies		5&rsquo;-labeled with 6-carboxyfluorescein (FAM) or Texas Red (for microscopy) or Cy5 (for cytometry), HPLC-purified
Variable speed microcentrifuge	Various		Use rotor diameter to calculate RPM needed for RCF values described in protocol
CoverWell perfusion chamber	Grace Bio-Lab Inc.	PC1R-2.0	Non-sterile
Gel loading pipette tips (FS MultiFlex)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	05-408-151	Long, thin tips for easy access to small sampling ports and maneuverability within chamber
Aluminum heat block or precision-controlled heating station	Various		Eppendorf Thermomixer R dry block heating and cooling shaker used here
Bambino mini hybridization oven	Boekel Scientific	Model 230300	Slides are placed in 50 ml polypropylene centrifuge tubes for hybridization, heat transfer not direct
Slide Moat slide hybridizer	Boekel Scientific	Model 240000	Provides rapid, direct transmission of heat through glass slide
Vectashield H-1200 mounting medium with 4&rsquo;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Vector Laboratories	H-1200	Minimizes quenching of fluorescence during microscopy, provides DAPI counterstain
Fluorescence microscope	Various		Leitz Laborlux S used here
Digital camera	Various		Canon PowerShot A640 camera used here
Image acquisition software	Various		Axiovision software v. 4.6 (Carl Zeiss) used
Adobe Photoshop	Adobe		For minimal processing of images (overlay of images taken in different channels)
Flow cytometer	Various		FACSCanto flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA) with red (647 nm) excitation used
Flow cytometry analysis software	Various		FlowJo software v. 8.7.1 (Tree Star, Inc.) used