Bu biyolojik membranlar elektrik modelleri kullanarak nasıl anlaşılabilir bir gösteri. Ayrıca öğrenci yönelik laboratuarlar için kerevit ventral sinir kordonundan aksiyon potansiyelleri kayıt prosedürleri göstermektedir.
Yöntem makalesi
Devre Biyolojik Membranlar Modelleme ve Aksonlar Elektrik Sinyalleri Ölçme: Öğrenci Laboratuvar Egzersizler
Bu makalede
Özet
Özet
Bu elektriksel modelleri biyolojik membranlar karakterize etmek için nasıl kullanılabileceğini bir gösteri. Bu egzersiz aynı zamanda biyofiziksel terminoloji elektrofizyoloji kullanılan tanıtır. Aynı ekipman, canlı hazırlıkları hakkında zar modeli kullanılır. Izole bir sinir kablosunun bazı özellikleri incelenmiştir: sinir aksiyon potansiyelleri, nöronlar alımı, ve sinir kablosunu çevresel faktörlere duyarlılığı.
Protokol
1. GİRİŞ
1.1) Giriş
Elektrik devreleriyle ilgili temel bilgi, fizyolojik deneylerin ve teorilerin birçok yönünü anlayıp kavramak için değerli bir araçtır. Bu alıştırma, voltaj kaynakları, elektrik direnci ve elektrik sığası (kapasitans) ile ilgili bazı genel ilkelerle sizi tanıştırmayı amaçlamaktadır. Bu temel kavramlar, sinaptik iletim ve sinir hücresi boyunca elektriksel sinyallerin yayılması gibi olayları anlamanın temelini oluşturur.
Dikkat edilmesi gereken bir nokta: Metal teller ve dirençlerden oluşan standart günlük elektrik devrelerinde AKIM, negatif yüke sahip olan elektronlar tarafından taşınır. Biyolojik sistemlerde ise akım, bir veya daha fazla pozitif ya da negatif yüke sahip olabilen İYONLAR tarafından taşınır. Kural olarak akım pozitif uçtan negatif uca doğru akar (elbette elektronlar aslında tam tersi yönde hareket eder).
Devrenin bileşenleri, canlı dokunun elektriksel özelliklerini ve bazı durumlarda bu dokunun incelenmesine dahil olan cansız nesnelerin (elektrodlar gibi) özelliklerini temsil eder.
Alıştırmayı yaparken sonuçlar ve hesaplamalar hakkında notlar tutun.
1.2) Genel İlkeler
Doğru akımın aktığı elektrik devrelerinin temel özellikleri Ohm Kanunu ile tanımlanır
V = IR
Burada V = volt cinsinden gerilim (V)
I = amper cinsinden akım (A)
R = ohm cinsinden direnç (Ω)
Bu yasa, elektrotlarla sinir hücrelerinde gözlemlenen potansiyelleri yönetir. İlk olarak Ohm Kanunu'nu ve biyolojik materyallerdeki uygulamasını göstereceğiz.
1.3) Malzemeler
| Öğe | Miktar |
| Breadboard | 1 |
| Dirençler: 330 K Ω | 1 |
| : 100 K Ω | 12 |
| : 33 K Ω | 6 |
| : 22 K Ω | 1 |
| : 10 K Ω | 6 |
| : 4.7 K Ω | 1 |
| : 2.2 K Ω | 1 |
| : 1.5 K Ω | 1 |
| : 1 K Ω | 1 |
| : 510 Ω | 1 |
| : 330 Ω | 1 |
| : 220 Ω | 1 |
| : 150 Ω | 1 |
| : 100 Ω | 1 |
| Kondansatörler: 0.1 μF | 6 |
| : 10 μF | 6 |
| Kablolar | 12 |
| PowerLab | 1 |
| PowerLab Çıkış Bağlantıları | 1 |
| PowerLab Giriş Bağlantıları | 1 |
| Voltmetre (Akım Ölçebilen) | 1 |
Direnç Kodlama Anahtarı
| Renk | Rakam |
| Siyah | 0 |
| Kahverengi | 1 |
| Kırmızı | 2 |
| Turuncu | 3 |
| Sarı | 4 |
| Yeşil | 5 |
| Mavi | 6 |
| Mor | 7 |
| Gri | 8 |
| Beyaz | 9 |
| Gümüş | %10 Tolerans |
| Altın | %5 Tolerans |
1inci Bant - 1inci Rakam
2nci Bant - 2nci Rakam
3üncü Bant - Sıfır Sayısı
4üncü Bant - Tolerans
Şekil 1: Sistem Kurulumu. Bilgisayar, deney tahtası ve çıkış uyaranı olan güç laboratuvarı.
PowerLab sistemi (AD Instruments, Avustralya'dan PowerLab arayüzü), bu deneyde voltaj kaynağı olarak kullanılacaktır. PowerLab'ın USB kablosunu bilgisayara bağlayın, PowerLab'ı açın ve masaüstünden LabChart programını başlatın. "Yeni Dosya" seçeneğini seçin. Birden fazla kayıt kanalı içeren bir pencere açılacaktır. Üst kısımda "Kurulum" seçeneğine tıklayın ve ardından "Kanal Ayarları"na tıklayın. Pencerenin sol alt köşesinde, Kanal Sayısını 1'e düşürün; 1. Kanalda, Aralığı 5 V olarak değiştirin. Uyaratıcı kabloyu, PowerLab'ın Çıkış bağlantı noktalarına bağlamak için iki mini kancalı uca takın: Kırmızı bağlantı kablosunu pozitif çıkış bağlantı noktasına, siyah bağlantı kablosunu ise negatif çıkış bağlantı noktasına bağlayın. Daha sonra, PowerLab'ın güç çıkışını, frekansını ve darbe süresini değiştirmek gerekir. Bunu yapmak için "Kurulum" seçeneğine, ardından "Uyaratıcı Paneli"ne tıklayın. Deneyin ilk kısmında 1,5 V'luk uzun darbelere ihtiyaç duyulduğundan, genliği 0,75 V'ye ayarlayın; bu, 1,5 V aralığı sağlayacaktır (PowerLab, pozitif ve negatif 0,75 V arasında dalgalanan bir voltaj çıkaracaktır). Frekansı (0,5 Hz) ve darbe süresini (1 s) ayarlayın.
Şekil 2: Deneysel devre şemaları. Yanlardaki renkli şeritler, her bir renk için tek bir birim halinde birbirine bağlıdır. Ortadaki 2 yatay sütun, her bir satır için sadece kendi yarısında birbirine bağlıdır, ancak orta çizgiden öteye veya yan şeritlere geçiş yoktur. Ortadaki her satır, bir sonraki satırdan bağımsızdır.
Bir deney tahtası kullanırken giriş ve çıkış uçları için iki tarafta ikişer sütun bulunur. Pozitif genellikle tüm boşlukların birbirine bağlı olduğu sağ pozitif sütuna bağlanır. Negatif giriş ise yine bir sütundaki tüm boşlukların birbirine bağlı olduğu deney tahtasının karşı tarafına bağlanır. Ortada, bu iki sütun seti arasında, birbirinden bağımsız olan beşer hücreden oluşan çok sayıda satır bulunur. Beş hücrelik bir satırdaki tüm hücreler birbirine bağlıdır ancak diğer satırlardan izole edilmiştir. Şekil 2'ye bakınız. Vurgulanan bölgeler, deney tahtasının hangi kısımlarının birbirine bağlı olduğunu gösterir. Deney tahtasının kullanımıyla ilgili yararlı bir video şu adreste bulunabilir: http://www.youtube.com/watch?v=oiqNaSPTI7w&feature=related
Alıştırma 1
Akımın aşağıdaki devreden geçmesini hesaplamak için Ohm Kanunu'nu kullanın:
Akım (Ağ 1): ________________A
Alıştırma 2
Direncin üzerindeki gerilimi, direncin direncini ve yukarıdaki devreden (Ağ 1) geçen akımı ölçün.
Şekil 3: Wavetek Meterman voltmetre.
Ağ 1'i 1500 Ω'lık bir direnç kullanarak deney tahtasında yeniden oluşturun; PowerLab gerilim kaynağı görevi görür (1,5 V). Gerilim, akım ve direnç ölçümleri Voltmetre ile yapılır. Voltmetrenin doğru veri toplayabilmesi için kırmızı ve siyah probların devrede çıplak tele temas etmesi gerekir. Ayrıca, kademe, herhangi bir bireysel deneysel düzeneğin ölçeğine uygun bir DC gerilim aralığına ayarlanmalıdır. Gerilim ölçümü için Voltmetrenin her iki probunu da direncin iki ucuna dokundurun. Direncin direnç değerini (gerilim düşümünü değil) ölçerken GERİLİM KAYNAĞINI DEVREDEN AYIRIN ve yine her iki probu da direncin üzerine dokundurun. Akımı ölçmek için Voltmetre devreye SERİ bağlanmalıdır; akım yönüne göre kırmızı ve siyah probların doğru şekilde yönlendirilmesi gerektiğini unutmayın.
Gerilim (Ağ 1): ________________V
Direnç (Ağ 1): ________________Ω
Akım (Ağ 1): ________________A
Şimdi Power Lab ile, daha önce voltmetre ile yaptığınız gibi, Network 2 üzerindeki (Network 1 ile aynı, ancak bir deney tahtasında) gerilimi ölçün. Voltmetreyi çıkarın ve kırmızı ile siyah klipsli gerilim ölçüm problarının uçlarını bağlayın. Daha sonra imleci kullanarak ekranın sağ tarafındaki "Channel 1" üzerine tıklayın. Tıklayıp "input amplifier" (giriş amplifikatörü) bölümüne gidin. Ardından kutunun içinde "differential" (farklısal) düğmesini tıklayarak aralığı 5 V olarak ayarlayın. Değişiklikleri kaydetmek için "OK" (tamam) düğmesine tıklayın.
Verileri toplamak için "Başlat" düğmesine (sağ alt köşe) tıklayın. Gerilim sapmalarını herhangi bir anda ölçmek için durdurabilirsiniz. Toplanan gerilimi ölçmek için "Durdur" düğmesine tıklayın ve "M" imlecini (sol alt köşe) sürükleyerek baz çizgisine getirin. Ardından serbest imleci gerilim izlemenin tepesine getirerek genliği ölçün. Gerilimdeki değişimi (ΔV) okuyun ve verileri kâğıda kaydedin. Sonuçları bağımsız bir voltmetre ile doğrulayabilirsiniz.
1.4) Seri Bağlı Direnç ve İletkenlik
Gerilim Bölücü Prensibi: Seri bağlı tüm dirençler üzerindeki toplam gerilim düşümü, kaynağın gerilimine eşittir. Her bir direnç üzerindeki gerilim, o direncin toplam direnç içindeki oranına bağlıdır. Dolayısıyla:
Bir direnç çifti, gerilimi kendi dirençlerinin oranında böler.
Alıştırma 3
Ağ 3'teki her bir direnç üzerindeki gerilim düşümünü hesaplayın. 1,5 V'lik kaynağı bağlıyken voltmetre ve güç laboratuvarı yazılımı ile gerçek gerilimi ölçerek hesaplamalarınızı kontrol edin.
AĞ 3. Yukarıda belirtilen iki direnci kullanın.
| Hesaplanan: | Ölçülen: |
| Gerilim (R1 Üzerinde):_______V | Gerilim (R1 Üzerinde): ________________V |
| Gerilim (R2 Üzerinde):_______V | Gerilim (R2 Üzerinde): ________________V |
1.5) Örnek Biyolojik Uygulama:
Bir sinir hücresinin iç kısmının ve dış çözeltisinin farklı elektriksel özellikleri, bir gerilim bölücüye örnek oluşturur. Bu biyolojik devre, dış elektrodlarla yapılan kayıtlar aracılığıyla incelenebilir. İyonların girdiği sinir hücresinin aktif bölgesi bir gerilim kaynağı gibi davranır; akım bu bölgeden hücre içine doğru ilerler ve dış çözelti aracılığıyla geri döner. Bu nedenle potansiyelleri farklı olan iki membran noktası arasında, elbette hem iç hem de dış kısımda aynı olan bir akım geçişi olur; iç direnç dış dirençten daha büyük olduğu için en büyük gerilim düşümü burada meydana gelir.
Sistemi ve eşdeğer devresini göz önünde bulundurun (Şekil 4: A. ve B.):
Eşdeğer Devre:
Şekil 4: A (üst). Biyolojik hücre zarı boyunca elektrik akımının akışı. B (alt). Eşdeğer elektrik devresi. Voltaj kaynağı (120 mV), sinir hücresinin aksiyon potansiyeli tarafından üretilen transmembran voltajıdır.
Not: Güç kaynağının konumu nedeniyle R0 ve Ri aslında paralel değil, seri bağlıdır. Devrenin eşdeğer çizimi şu şekildedir:
Şekil 5: Şekil 4A için alternatif eşdeğer elektrik devresi.
Alıştırma 4.
Aşağıdakiler verildiğinde:
Vm, membran boyunca potansiyel = 120 mV
Ri, iç sıvının direnci = 106 Ω
R0, dış sıvının direnci = 104 Ω
Elektrot A ve B arasındaki V0 potansiyelini hesaplayınız.
V0: ________________V
Alıştırma 5.
Ağ 4'ü kullanarak (aşağıya bakın), her bir direnç üzerindeki (R0 ve Ri) potansiyelleri ölçün.
AĞ 4. 4,7 K Ω ve 10 K Ω dirençleri 1,5 V kaynakla seri bağlayın:
Voltmetrenizle gerilimleri ölçün.
Gerilim (R0 üzerinde): ________________V
Gerilim (Ri üzerinde): ________________V
AĞ 5: R0 = 1 K Ω dışında, Ağ 4 ile aynı
Ağ 5'te harici direncin çok daha düşük olduğuna dikkat edin (elektrodları şöntleyen çok miktarda sıvı veya inaktif doku olması durumuna benzer); bu nedenle harici direnci artırmak için sinirlerin hava içinde veya yalıtkan yağ altında kaydedilmesi önemlidir.
Gerilim (R0 üzerinden): ________________V
Gerilim (Ri üzerinden): ________________V
1.6) Seri ve Paralel Bağlı Dirençler ve İletkenlik
Biyolojik Uygulama Örneği:
Seri ve paralel bağlı dirençlere bir örnek, kimyasal sinaptik iletimin elektriksel yapısıdır. Elektriksel iletim, sinaptik aralığın kısa devre etkisi nedeniyle çoğu sinaps boyunca mümkün değildir. Ancak bu kısa devrenin, presinaptik membranda büyük bir potansiyelin oluşmasını ve bununla birlikte nörotransmitter salınımını sağlayabilmesi muhtemeldir.
Şekil 6: Bir sinaps boyunca elektrokimyasal akışın modeli.
Canlı doku içinde, membranlarda ve kısıtlı ekstrasellüler alanlarda önemli elektriksel dirençler oluştuğunu unutmayın. Hücre sitoplazması veya banyo solüsyonları gibi nispeten büyük sıvı alanları önemli dirençler oluşturmaz.
Alıştırma 6.
Ağ 6 (yukarıya ve Devre Kartı'na bakın), kimyasal sinaptik iletimin bir benzeridir. Elektriksel sinaptik iletimde, sinaptik boşluk (şönt direnci Rs) ortadan kaldırılır ve akım presinaptik hücreden postsinaptik hücreye doğrudan Rm1 ve Rm2 üzerinden, ardından Rm3 üzerinden geçerek akar. Ağın zayıflaması, farklı sinapslarda meydana gelen değişiklikleri göstermek için çeşitli direnç değerleriyle kolayca ölçülebilir. PowerLab cihazınızı 1,5 V ile bağlayın (yani 0,75 Volt ayarı).
- Sağlanan ağdaki her bir direnç boyunca potansiyel farkını (PD), multimetre kullanarak ölçün. Dirençlerin değerlerini not edin. Rm3'ün (postsinaptik hücrenin membranı) boyunca olan PD'ye özel olarak dikkat edin. Gerilim: ________________V
- Rs'deki 330 Ω direnci, 330K Ω'lık bir dirençle değiştirin. Rm3 noktasındaki PD'yi ölçün.
- Şimdi Rs'yi 330K Ω'da sabit tutarak, Rm2'deki 330K Ω'lık direnci 33K Ω'lık bir dirençle değiştirin. Rm3 boyunca PD'yi ölçün. Gerilim: ________________V
- Şimdi Rs'yi 330K Ω ve Rm2'yi 33K Ω'da sabit tutarak, Rm1'deki 22K Ω'lık direnci 220 Ω'lık bir dirençle değiştirin. Rm3 boyunca PD'yi ölçün. Gerilim: ________________V
Alıştırma 7
Seri-paralel dirençli ağlara bir örnek, sinir veya kas hücresinin kablolu özelliklerini düşünürken karşımıza çıkar. Bir lifin UZUNLUK SABİTİ, membran boyunca bir potansiyel farkın (PD) orijinal değerinin %37'sine düştüğü mesafedir. Bu zayıflama, membranın her iki tarafındaki sıvının iç ve dış dirençlerinin (göreli olarak yüksek olan) transvers membran direnci tarafından kısa devre yapılması sonucu meydana gelir. Direncin değeri, bir sinir hücresinin aksonu boyunca sinyal iletimini sınırlar. Uzunluk sabiti, üstel bir azalma için 1/e olarak ölçülür. dE/dT=-E/RC; burada E voltaj farkını, R direnci ve C kapasitansı temsil eder. Ya da başka bir biçimde E=Eoexp (-t/RC); burada Eo başlangıç voltajı ve t saniye cinsinden zamandır. RC ayrıca tau (τ), yani zaman sabiti olarak da adlandırılır.
İç hücresel ve membran dirençlerine kıyasla dış sıvının direncinin ihmal edilebilir olduğunu varsayarsak, membranın pasif dirençsel özellikleri şu devre ile temsil edilebilir:
Şekil 7: Ağ 7'nin deney tahtası kurulumuna çevrimi.
A ve B arasında Ağ 7'nin bir ucuna bir voltaj uygulayın. 1 saniye süre, 1 V genlik (0,5 V'a ayarlı) ve 0,75 Hz frekansında bir darbe seçerek bir uyarıcı kullanın. Voltmetreyi sırayla her bir "zar" direnci boyunca bağlayın ve o direnç üzerindeki potansiyel farkını (PD) not edin. Diğer uç probu sırayla 1-5 konumlarına hareket ettirirken voltmetre probunun bir ucunu sabit tutun (A-ucu, Kırmızı). Her değeri, kaynaktan "mesafe"ye karşı potansiyel farkının grafiğine çizdirin; zar dirençleri birim mesafede aralıklı olsun. Grafiğinizden bu devrenin uzunluk sabitini belirleyin. 
Ağ 7 Uzunluk Sabiti Grafiği:______________
Miyelin kılıf ile meydana gelebileceği gibi, transvers membran direncindeki bir artışın veya lif çapının artmasıyla ilişkili longitudinal iç dirençteki bir azalmanın etkisi, uzunluk sabitinde bir değişikliktir. Dirençlerin değerleri gerçek bir sinir aksonunda bulunanlar değildir, ancak yaklaşık olarak orantılıdır. Benzer şekilde, modeldeki "birim mesafe", gerçek bir sinir hücresinden önemli ölçüde büyütülmüştür.
1.7) Kapasitans
Kondansatörler yük depolar. Bir direnç üzerinden bir kondansatöre gerilim uygulanırsa, kondansatöre akım akar ve ardından kondansatör boyunca potansiyel fark (PD), kaynağın PD'sine doğru zamanla üstel olarak artar; bu gerilim değişimini zaman izlenimi, uygulanan gerilime, kapasitansa ve seri dirence bağlıdır. Bir kondansatör deşarj olduğunda benzer ancak tersine dönmüş bir zaman izlenimi görülür.
Bu basit Direnç-Kondansatör (RC) ağını, A ve B noktalarında uyarıcınıza bağlayın. 1 saniye süreli ve 0,75 Hz frekanslı 1 V (0,5 V'a ayarlı) darbeler kullanın. Ayrıca veri toplamayı 20 K/saniye'ye ayarlamalısınız (panelin sağ tarafı). Giriş kelepçelerinizi PowerLab'dan kondansatörün iki ucuna bağlayın. Birkaç saniye toplayın ve sonra durdurun. Kare darbelardan birinin yükselme zamanını genişletmek için Yakınlaştır penceresini kullanın. İzlemenin açılması için yakınlaştırmayı birkaç kez tekrarlamak gerekebilir. Gerilim izlemenin düzleşmeye başladığı noktaya kadar, temel çizgiden tepeye kadar olan yükselme zamanını ölçün. Potansiyel değişimini zaman izlenimini ve kare darbelerdeki bozulmayı gözlemleyin. 10μF'lik kondansatörü 0,1 μF'lik bir kondansatörle değiştirerek etkisini gözlemleyin. PowerLab voltaj problarınızı direncin üzerine bağlayarak devreden geçen akımın zaman izlenimini gözlemleyebilirsiniz. Sadece birkaç darbe toplayın ve sonra durdurun ve ölçüm yapın. Yükselmeden önceki temel çizgiye gitmek için "M" imlecini ve gerilimin düzleşmeye başladığı yere gitmek için serbest imleci kullanın.
Son örnek hem dirençsel hem de kapasitif bileşenleri içermektedir. Sinir ve kas iplerinin pasif kablo özellikleri, hücre zarı özelliklerinden kaynaklanan benzer elemanlarla belirlenir. Hücrede yalnızca enine zar direnci değil, aynı zamanda hücre zarının elektriksel özelliklerinden kaynaklanan bir zar kapasitansı da vardır. Bunun etkisi, elektrotonik olarak yayılan potansiyellerin gelişiminin zaman izlemini etkilemesidir.
Örnek:
Bu ağ, membran dirençlerine (Rm) gerekli kapasitörleri paralel olarak bağlayarak Ağ 7'den oluşturulabilir.
Alıştırma 8.
10 μF kondansatörleri Şebekeye 7 bağlayın. Uyarıcıdan 1 s, 1 V (0,5 V ayarı) ve 0,75 Hz darbelerini A ve B noktalarına bağlanmış şekilde uygulayarak her bir membran direnci boyunca potansiyel değişimlerini gözlemleyin. Bir sinir hücresinde aksiyon potansiyelinin üretildiği "eşik" voltajını 0,2 V kabul ederek, her bir membran direncinde potansiyelin eşik değerine ulaşması için geçen süreyi ölçün. Burada eşik, canlı bir hücrede aksiyon potansiyelinin üretilebileceği potansiyel değerini ifade eder. Sonuçlarınızı zamanı 'mesafe'ye karşı grafik üzerinde gösterin.
Şekil 8: Ağ 9'un breadboard kurulumuna aktarılması.
Şekil 8 için grafik.
Miyelin kılıfının kalınlığının artması sonucu oluşan membran kapasitansındaki azalmanın etkisini, daha küçük olan 0,1 μF kapasitörlerle değiştirerek simüle edin. Seçilen bir dirençte eşik değerine ulaşmak için gereken süredeki değişikliği not edin. Daha büyük kapasitörler yerindeyken elde edilen verilerle aynı grafiğe üst üste yerleştirin.
Bir kas zarı açısından düşünüldüğünde, T-tübülleriyle ilişkili olarak zar yüzey alanının artması, bir nörondakine kıyasla daha büyük bir zar kapasitansına neden olur. Miyelinsiz bir sinir aksonuna myelin eklenmesiyle kapasitansın azalmasını göstermek için daha küçük kapasitörler kullanılabilir. Burada öğrenilmesi gereken temel nokta, elektriksel kapasitansın yüzey alanıyla orantılı olduğudur ve kapasitörün "plakaları" ya da depolama yüzeylerini ayıran dielektrik tabakanın (myelin) kalınlığıyla ters orantılıdır.
Bir model devrede sunulan özellikler canlı preparatlarda gözlemlenir. Ancak hücreler, membran boyunca sızıntı ve eksenel direnç gibi özelliklerinde farklılık gösterir. Bazı hücreler aksiyon potansiyeli üretmez. Ancak birkaç milimetre boyunca sinyallerin iletilmesi gerektiğinde bir aksiyon potansiyeli üretilir çünkü hücrelerin pasif elektriksel özellikleri birkaç milimetre boyunca sinyalleri zayıflatır. Bir sonraki deney serisinde aksiyon potansiyellerinin kaydı gösterilmiştir.
1.8) Öğrenciler için sorular
- Nöronlar ve kas hücreleri için uzunluk sabitinin normal değerleri nelerdir?
- Bir membran düşük membran direncine sahip olsaydı, zaman sabiti (son değerinin %63'üne ulaşma süresi) değişir miydi? Eğer öyleyse, daha düşük bir membran direnciyle nasıl değişirdi? Zaman sabiti (tau) için genelleştirilmiş matematiksel formül nedir?
- Neden aynı kalamar preparatında, kalamarın dev aksonu gibi daha büyük aksonlar elektriksel sinyalleri daha küçük aksonlardan daha hızlı iletebilir?
2. SİNİR HÜCRELERİNİN İLETİM ÖZELLİKLERİ
2.1) Deneysel tahtadan canlı hücrelere
Devre kartı uygulamalarında gösterilen pasif özellikler aynı zamanda canlı hücrelerde de ölçülebilir; ancak bu pasif özellikler, sinir hücrelerinde aksiyon potansiyelleriyle birlikte ortaya çıktığında ayırt etmek daha karmaşık hâle gelebilir. Nöronun aktif özellikleri, dinlenme membran potansiyelini koruma, aksiyon potansiyelleri oluşturma ve bunları membran boyunca yeniden oluşturma yeteneğidir.
Bir sinir kordonu boyunca elektriksel akım, tek tek nöronlar içinde ve bir nöronun diğerine geçerken de yenileyici olabilir. Sırtlan karıncası (crayfish) ventral sinir kordonunda (VNC), bazı nöronlar septal (yani geçit) bağlantılar aracılığıyla iletişim kurar. Daha önceki deneylerde deney tahtasında gösterildiği gibi, direncin değiştirilmesi elektriksel sinyallerin iletimini engelleyebilir. Bu, ventral sinir kordonu içindeki geçit bağlantıları boyunca akımın akışının değiştirilmesine benzer.
VNC'deki bileşik aksiyon potansiyelinin iletim hızı ve diğer özellikleri, bir sonraki deney serisinde incelenecektir. Deney amaçlı VNC'nin nasıl elde edileceğini ve öğrenci laboratuvarları için tasarlanmış standart ekipman kullanarak yanıtların nasıl oluşturulup ölçüleceğini göstereceğiz.
2.2) Sırtlan karidesi preparatı
Bu deney için sırt karıncası (crayfish) karın sinir kordonu en uygundur. Sinir kolayca disseke edilebilir ve iletimi etkileyen çeşitli protokoller bu preparatla kullanılabilir. Bu deneye başlamadan önce aşağıdaki sırt karıncası anatomisi terimlerine aşina olun:
Şekil 9. Genel sırt karıncası anatomisi şeması.
Değiştirilmiştir: http://www.enchantedlearning.com
2.3) Bir sinirde iletimle ilgili arka plan bilgisi
Sırtüstü kabuklunun (crayfish) ventral sinir kordonu, kuyruk kıvırma tepkimesi gibi kaçış tepkilerini başlatan sinyallerin iletiminde görev alır. Bu deneyde, tümüyle bütünlüğünü koruyan sinir kordondan kayıt alınacaktır. Sinir kordonu içindeki her bir nöronun bireysel potansiyelleri toplanarak bileşik aksiyon potansiyelini oluşturur ve bu da kayıt yazılımı tarafından gösterilen ölçülebilir elektriksel darbeleri sağlar. Erlanger, Gasser ve Bishop (1924), bileşik aksiyon potansiyellerini tanımlayan öncülerdendir. Refraktör periyodun özellikleri, iletim hızı ve gap junction inhibitörü 1-heptanol'ün ya da sıcaklığın nöral etkileri gösterilmiştir. Sinir hücresi sinyallerinin temel ilkelerini öğrenmek, nörolojik işlevin genel olarak daha iyi anlaşılmasına katkı sağlar (Bennett, et al., 1991; Furshpan et al., 1959; Watanabe ve Grundfest, 1961).
2.4) Malzemeler
| Öğe | Miktar |
| Büyük Sırtlan Karidesi (Procambarus clarkii) | 1 |
| Hassas Kesme Makası | 1 |
| Forseps | 1 |
| MLT016/X Sinir Odası | 1 |
| Scope Yazılımı ile Dizüstü Bilgisayar | 1 |
| PowerLab | 1 |
| PowerLab Amplifikatörü | 1 |
| PowerLab için Uyarıcı Çıkış Kablosu | 1 |
| USB PowerLab/Bilgisayar Bağlayıcısı | 1 |
| Emici Elektrotlu Manipülatör Standı | 1 |
| Fitilli Cam Pipet | 1 |
| Karides Tuzlu Suyu İçeren Beher | 1 |
2.5) Yöntemler
2.5.1) Diseksiyon
Bir yengeci disseke etmeden önce sinir kabı, çeşitli enstrümanlar ve çözeltilerin hazırlanmış olduğundan emin olun.
- Kısa boynuzlu ıstakozu tutmak için nemli kağıt havluyla sarın ya da kısa boynuzlu ıstakozu bir elinizle tutarken kıskaçlı bacakları (kılçık bacaklar) başparmak ve işaret parmağınızın arasına alın.
- Diğer elinizi kullanarak makasla göz yuvaları arasındaki burun kısmından bir kesik yapın.
- Kesikten başlayarak aşağı doğru keserek kafayı tamamen koparın.
- Başgövdenin (sefalotoraks) karın kısmının hemen üzerindeki taban kısmına bir kesik yapın; kuyruğu çıkarın. (Gerekirse bu işlemi kolaylaştırmak için kılçık bacaklar ve yürüme bacakları çıkarılabilir.)
- Yüzme bacaklarını (swimmeretleri) çıkarın.
- Karının alt yüzünün her iki tarafı boyunca bir kesik yapın. Derin dokulara zarar vermemeye dikkat edin.
- Dış iskeletin serbest bırakılan kısmını kuyruk fanının tabanına kadar gerdirerek ventral sinir kordonunu ortaya çıkarın.
- Forsepsin kenarını kullanarak sinir kordonunun ucundan ventral sinir kordonunu dikkatlice çıkarın. Sinir kordonunu germeyin veya ezmeyin. (Sinir kordonunda gözlemlenen herhangi bir nodül, kısa boynuzlu ıstakoz gangliyonlarıdır.)
- Sinir kordonunu sinir odasındaki metal çubuklar boyunca yerleştirin. Ventral sinir kordonunun nemli tutulması çok önemlidir. Bunu sağlamak için sinir odasına, sıvı seviyesi metal enine çubuklarla aynı hizaya gelene kadar yeterli miktarda kısa boynuzlu ıstakoz fizyolojik çözeltisi ekleyin. Ardından, sıvı seviyesinin metal çubukların alt kısımlarına hafifçe temas edecek kadar olmasına dikkat ederek, pipetle fazla kısa boynuzlu ıstakoz fizyolojik çözeltisini çıkarın.
Kısa Boynuzlu Istakoz Fizyolojik Çözeltisi (mM: 205 NaCl; 5.3 KCl; 13.5 CaCl2.2H2O; 2.45 MgCl2.6H2O; 5 HEPES, pH 7.4'e ayarlanmış) - Sinir yerine oturduğunda, iki mini kanca uçlu stimülatör kablosunu sinir odasına bağlayın. Pozitif kırmızı ucu sinir kordonunun ucundaki metal halkalardan birine bağlayın; negatif siyah ucu sinir kordonuna hâlâ temas eden en yakın bitişik metal halkaya bağlayın.
- Emici elektrodu manipülatör içinde sinirin karşı ucuna yakın konumlandırın.
- Ventral sinir kordonunun ucunu kaydederken dikkatlice emici elektroda çekin.
2.5.2) Kayıt alma
Sinir kordonunun ucu kayıt elektroduna emildikten sonra, elektrodun proba takıldığından ve probun yeterince topraklandığından emin olun. Bu, toprak kablosunu Faraday kafesine bağlayarak kolayca gerçekleştirilebilir. Pozitif ve negatif emme elektrot kabloları da prob üzerindeki karşılık gelen yerlere bağlanmalıdır. Prob, sırasıyla PowerLab'a bağlı olan diferansiyel amplifikatöre bağlanmalıdır.
Emme elektrodundan gelen elektrik kablolarını baş evresine bağlayın. Kablolar, soldan yukarı doğru kırmızı (pozitif), ortada yeşil (toprak) ve aşağıda siyah (negatif) olacak şekilde bağlanmalıdır. Bu, aşağıdaki baş evresi için Şekil 10'da gösterilmiştir. Toprak kablosu, tuzlu su banyosuna yerleştirilebilir. Böylece emme elektrodundan bir kablo + girişine, diğeri ise - girişine bağlanır. Emme elektrodundan gelen kabloların hangisinin + veya - girişlerine gittiği önemli değildir.
Şekil 10: Baş evresi için girişler
Yükseltici için ayarlar şu şekildedir:
| KONTROL | AYAR |
| Yüksek Geçirgenlik | DC |
| Notch Filtre | KAPALI |
| Düşük Geçirgenlik | 20kHz |
| Kapasite Telafisi | Saat Yönünün Tersine |
| DC Ofset İnce ve Kaba Düğmesi | Saat Yönünün Tersine |
| DC Ofset (+OFF) | KAPALI |
| Kazanç Düğmesi | 50 |
| Giriş (DIFF MONO GND) | DIFF |
| KIP (STIM-GATE-REC) | GATE |
| ΩTEST | KAPALI |
Verilen USB kablosunu PowerLab'ın arkasına ve bilgisayarın bağlantı noktasına bağlayın. Bilgisayar masaüstünde Scope yazılımını açın. Ekranın sağ üst kısmında "Kanal 2"yi seçin ve kapatın. Ekranın ortasındaki çubuğu aşağıya kaydırarak yalnızca Kanal 1'in görünmesini sağlayın. Daha sonra ekranın sağ üst kısmında yer alan Kanal 1 için "Giriş Yükselticisi"ne tıklayın. Aşağıdakileri seçin:
| KONTROL | AYAR |
| ARALIK | 500 mV |
| AC | SEÇİLİ |
| DÜŞÜK GEÇİŞ | KAPALI |
| TAKOZ | SEÇİLİ |
| TERS ÇEVİR | SEÇİLİ |
Ardından, yine "Kurulum" altında "Örnekleme" seçeneğine tıklayın. Görüntülenen ekranda "Tarama" başlıklı kutuda aşağıdakileri seçin:
| KONTROL | AYAR |
| KIP | ÇOKLU |
| ÖRNEK | 100 TARAMA |
| KAYNAK | KULLANICI |
| GECİKME | 0 SANİYE |
Son olarak, "Kurulum" sekmesi altında "Uyarıcı" seçeneğini belirleyin. "İzole Uyarı" seçeneğini kapatmak için kutuya tıklayın. Aşağıdaki ayarları seçin:
| KONTROL | AYAR |
| KIP | ÇOKLU |
| GECİKME | 5 ms |
| SÜRE | 1 ms |
| İMPULS(LAR) | 2 |
| ARALIK | 15 ms |
| GENİŞLİK | 5 V |
| GENLİK | 0.5 |
Sağ panelde "Zaman Tabanı"nı görün. "Örnek" değerini 1024'e ve "Zaman"ı 200 milisaniyeye değiştirin.
Şekil 11: Scope yazılımı ile kaydedilen, uyarılar arasında 15 milisaniye aralıkla iki bileşik aksiyon potansiyeli.
Alıştırma 1.
Ekranın sol altındaki "Başlat" düğmesini seçin. Yukarıdaki ayarlarla, bileşik aksiyon potansiyelinin açıkça tanımlanmış bir sinyali, Kapsam veri toplama kutusunda görünmelidir (Şekil 11). Aksiyon potansiyelinin genel şeklini aşağıdaki grafiğe çiziniz (Şekil 12):
Şekil 12: Bileşik aksiyon potansiyelinin şeklini çizmek için boş grafik.
Ekranın sol üst köşesindeki sekme kullanılarak voltaj yavaşça azaltılmalıdır. Aksiyon potansiyeli, karakteristik dalga deseninin de kaybolacağı şekilde büyüklük olarak küçülmelidir. Voltajın azaltılması, bileşik aksiyon potansiyelini ateşlemek için devreye giren nöron sayısını azaltır. Daha büyük çaplı aksonlar muhtemelen daha düşük voltajlarda devreye girer ve daha hızlı iletme özelliğine sahiptirler, bu yüzden bileşik aksiyon potansiyelinde ilk görünenler olurlar. Daha fazla nöronun devreye girmesiyle birlikte bileşik aksiyon potansiyeli dalgasının büyümesini gözlemlemek için voltaj kademeli olarak artırılmalıdır. Bu egzersiz, bireysel nöronların aksiyon potansiyeli üretiminde farklı eşiğe sahip olduklarının bir göstergesidir. Uyarıcı voltajın artırılmasına rağmen bileşik aksiyon potansiyeli daha fazla artmıyorsa, tüm nöronlar devreye girmiştir; bilgisayar ekranında aksiyon potansiyeli dalgasında iki ayrı tepe görülür.
Alıştırma 2.
Nöron devreye girme sürecini ve bunun sonucunda oluşan bileşik aksiyon potansiyelini inceledikten sonra, refraktör periyodun etkisini gözlemleyin. Bu, iki uyaranı birbirine çok yakın zamanlarda vererek ve uyaranlar arası aralığı değiştirerek, ardından ikinci uyaranın oluşturduğu bileşik aksiyon potansiyelinin genliğinin birinci bileşik aksiyon potansiyeline kıyasla ne zaman azaldığını gözlemleyerek yapılabilir. Darbeler arasındaki gecikmeyi, ekranın sol üst köşesindeki sekme kullanarak değiştirin. İkinci bileşik aksiyon potansiyeli elde edilemeyinceye kadar gecikmeyi kısalmaya devam edin. İkinci bir aksiyon potansiyelinin artık oluşturulamadığı darbeler arası süre, mutlak refraktör periyottur. Mutlak refraktör periyodun sonundan, ikinci bir uyaranın tam genlikli bir aksiyon potansiyeli oluşturduğu ana kadar geçen süreye ise nispi refraktör periyot denir. Aşağıda belirtilen boşluklara mutlak ve nispi refraktör periyotlar için birer tahmin yazın.
Mutlak Refraktör Periyot: ___________________
Nispi Refraktör Periyot: ___________________
2.5.3) İletim hızını ölçme
Milimetrelik bir cetvel kullanarak kayıt elektroduna en yakın uyarıcı tel ile kayıt elektrodu arasındaki mesafeyi ölçün. Kaydedilen izden, bileşik potansiyeldeki olayların çeşitli tepeciklerine kadar geçen süreyi ölçün, böylece çeşitli elektriksel sinyallerin iletim hızlarını kaydedebilirsiniz. Milimetre cinsinden mesafeyi metreye, milisaniye cinsinden süreyi saniyeye çevirerek metre/saniye birimini elde edin.
1inci dalga formu iletim hızı: __________________
2nci dalga formu iletim hızı: __________________
3üncü dalga formu iletim hızı: __________________
4üncü dalga formu iletim hızı: __________________
2.5.4) Boşluk bağlantılarının ve/veya iletim hızının manipülasyonu
Daha sonra, bir nöronal inhibitörün özelliklerini inceleyin. Johnston et al. (1980) tarafından sırtüstü karidesin bölünmüş aksonlarında (yani geçit bağlantılarında) heptanolün ayrıştırıcı etkisi ilk kez tanımlanmıştır. Elektriksel iletişimi ilgilendiren bu etki, çeşitli omurgalı ve omurgasız sistemlerde kısa sürede doğrulanmıştır (Bernardini et al., 1984; Meda et al., 1986). Bu ventral sinir kordunda elektriksel iletişimin rolünü anlamak için, geçit bağlantılarını ayrıştırmak amacıyla (1 mM) 1-heptanol içeren bir serum fizyolojik kullanılabilir. Bir cam pipet kullanarak, heptanol çözeltisiyle tüm sinir kordunu yıkayın. Scope kayıt yazılımı tarafından kaydedilen değişikliği gözlemleyin ve özetleyin. (Dalga formundaki değişikliğe ve dalga formlarının iletim hızında bir değişiklik olup olmadığına dikkat edin.) Alternatif olarak, 1-heptanol kullanmak yerine, banyo sıvısı buz gibi soğuk serum fizyolojikle değiştirilebilir ve dalga formunda veya dalga formlarının iletim hızında herhangi bir değişiklik izlenebilir.
Tartışma
On-line video sunum ve bu yazıda amacımız hücrelerinin biyofiziksel özellikleri, kısmen, elektrik devreleri olarak modellenmiş olduğunu göstermektir. Buna ek olarak, nispeten daha kolay elde edilir canlı sinir dokusu ile, mütevazı bir ekipman yatırımları ile lisans öğrencisi laboratuarlar için iletim hızı, refrakter, dönemlere ve elektrofizyolojik kayıt teknikleri temel ilkeleri mümkündür. Temalar ve sunulan temel paradigmalar farklı derslerin gereksinimleri için kolayca değiştirilebilir.
Kerevit ve bolluk Bakım öğrenci odaklı bir deney için, onları çekici modelleri kılar. Kabuklu ventral sinir kabloları genellikle sağlam ve 3 saatlik bir öğrenci laboratuar için yeterli olan en az bir saat boyunca tuzlu su, fizyolojik bütünlüğünü korumak.
Kerevit VNC büyük akson bazı standart kurbağa siyatik sinir hazırlanmasında bulundu gösterilenden daha gap junction, katkılarının ek deney yapılabilir ve farklı özellikleri ile bağlı olduğu göz önüne alındığında. Siyatik siniri bileşik aksiyon potansiyelleri ve iletim özellikleri adresleme için klasik bir model. Hatta ilginç bir karşılaştırmalı iletim özelliklerini karşılaştırmak için öğrenciler için deney, akson işe alım ve bu iki hazırlıkları arasında refrakter dönemler olabilir.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Bu deneyler, bir kursta kullanılan bir laboratuvar kılavuzu, Toronto Üniversitesi, Zooloji Anabilim Dalı, Dr. HL Atwood tarafından yönetilen modifiye edilmiştir. Egzersizleri de kullanılan ve "ON TEMEL SİNİRBİLİM 6. YOĞUN IBRO ÇALIŞTAYI" için üretildi ve 1993 (Cooper ve ark, 1993), Kore Üniversitesi, Seul, Güney Kore'de düzenlenen bir kılavuz değiştirilmiş . Mevcut değişiklikler, çeşitli üniversitelerde, gün öğrenci yönettiği laboratuarları sunmak ortak ekipman kullanımı için gerekli. Kentucky Üniversitesi, Biyoloji Bölümü, Lisans ve College of Arts & Sciences Ofisi tarafından desteklenir.
Malzemeler
Devre kartı
- Breadboard deneyler için aşağıda listelenmiştir Elektronik, Radio Shack gibi bir yerel elektronik mağazasından elde edilebilir.
- Ekmek tahtası, dirençler, kapasitörler, piller ve teller deneyler belirtildiği gibi breadboard için kavşak olarak hizmet verebilir.
- Ortak bir voltmetre (Wavetek Meterman voltmetre)
- A / D kurulu bir bilgisayar line kayıt için. Elektrik sinyalleri, bir PowerLab/4s arayüz (ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA) hattı üzerinde kaydedilir. Grafik veya Kapsam adlı ADInstruments standart yazılım kullanın.
Fizyoloji deneyler
- Kerevit (Procambarus clarkii). Atchafalaya Biyolojik Supply Co, Raceland, LA, ABD.
- Standart kerevit salin: Van Harreveld çözümü (1936) modifiye edilmiştir. (MM) 205 NaCl; 5.3 KCl; 13.5 CaCl 2 2H 2 O; 2.45 MgCl 2 6H 2 O 5 Hepes ve pH 7.4 'e ayarlanır. Tüm tuzlu su kimyasalları, Sigma kimya şirketi (St. Louis, MO) elde edilmiştir.
- Diseksiyon araçları: # 5 cımbız Güzel, ince makas, bıçak tutucu, # 26.002-20 böcek pimleri (Güzel Bilim Araçları (USA), Inc, 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94.404-1139 elde)
- Bir sinir odası sinir tutmak için çanak (ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA). Sinir odası çanak ile gelen telleri siniri uyarmak için kullanılabilir.
- Emme elektrot sinyallerini kaydetmek için kullanılır.
- Manipülatör veya bir halka standında bir kelepçe de emme elektrot için tutucu olarak görev yapacak.
- Faraday Kafesi
- Diseksiyon Mikroskop
- Yüksek Yoğunluklu Aydınlatıcı (ışık kaynağı)
- Mikroskop Platformu
- AC / DC Diferansiyel Amplifikatör (AM Systems Inc Model 3000)
- PowerLab 26T (AD Aletleri)
- Ekstrasellüler amplifikatör (AD Aletleri)
- LabChart 7 (ADI Aletleri)
- Diseksiyon araçları
- Halka stand ve kayıt emme elektrot için tutucu olarak hizmet vermeye kelepçe
Kaynaklar
- Bennett, M. V. L., Barrio, L. C., Bargiello, T. A., Spray, D. C., Hertzberg, E., Sdez, J. C. Gap junctions: new tools, new answers, new questions. Neuron. 6, 305-320 (1991).
- Bernardini, G., Peracchia, C., Peracchia, L. L. Reversible effects of heptanol on gap junction structure and cell-to-cell electrical coupling. European Journal of Cell Biology. 34 (2), 307-312 (1984).
- A report on the, "SIXTH INTENSIVE IBRO WORKSHOP ON BASIC NEUROSCIENCE". Cooper, R. L., Chang, J. J., Ito, M. July 1993, Seoul, South Korea, , Society for Neuroscience. 116-116 (1985).
- Cragg, B. G., Thomas, P. K. The relationship between conduction velocity and the diameter and internodal length of peripheral nerve fibers. Journal of Physiology. 136, 606-614 (1957).
- Erlanger, J. G. asser, S, H., Bishop, G. H. The compound nature of the action current of nerves as disclosed by the cathode ray oscillograph. American Journal of Physiology. 70, 624-666 (1924).
- Furshpan, E. J., Potter, D. D. Transmission at the giant motor synapses of the crayfish. Journal of Physiology. 145 (2), 289-325 (1959).
- Johnston, M. F., Simon, S. A., Ramrn, F. Interaction of anesthetics with electrical synapses. Nature (Lond). 286, 498-500 (1980).
- Loewenstein, W. R. Permeability of membrane junctions. Annual NY Academy of Sciences. 137, 441-472 (1966).
- Meda, P., Bruzzone, R., Knodel, S., Orci, L. Blockage of cell-to-cell communication within pancreatic acini is associated with increased basal release of amylase. Journal of Cell Biology. 103 (2), 475-483 (1986).
- Peracchia, C. Increase in gap junction resistance with acidification in crayfish septate axons is closely related to changes in intracellular calcium but not hydrogen ion concentration. Journal of Membrane Biology. 113 (1), 75-92 (1990).
- Peracchia, C., Dulhunty, A. F. Low resistance junctions in crayfish: structural changes with functional uncoupling. Journal of Cell Biology. 70, 419-439 (1976).
- Peracchia, C., Bernardini, G., Peracchia, L. L. Is calmodulin involved in the regulation of gap junction permeability. Pfügers Arch. 399, 152-154 (1983).
- Peracchia, C., Lazrak, A., Peracchia, L. L. Molecular models of channel interaction and gating in gap junctions. Handbook of Membrane Channels. Molecular and Cellular Physiology. Peracchia, C. , Academic Press. San Diego. 361-377 (1994).
- Spray, D. C., Harris, A. L., Bennett, M. V. L. Gap junctional conductance is a simple and sensitive function of intracellular pH. Sciences NY. 211, 712-715 (1981).
- Spray, D. C., Harris, L. L., Bennett, M. V. L. Comparison of pH and Ca dependence of gap junctional conductance. Intracellular pH: Its Measurement, Regulation, and Utilization in Cellular Functions. Nuccitelli, R., Deamer, D. , Alan R. Liss. New York. 445-461 (1982).
- Spray, D. C., White, R., De Carvalho, C., Harris, A. L., Bennett, M. L. V. Gating of gap junction channels. Journal of Biophysics. 45, 219-230 (1984).
- Watanabe, A., Grundfest, H. Impulse propagation at the septal and commissural junctions of crayfish lateral giant axons. Journal of General Physiology. 45, 267-308 (1961).
- Wiersma, C. A. G., Hughes, G. M. On the functional anatomy of neuronal units in the abdominal cord of the crayfish, Procambarus clarkii. Journal of Comparative Neurology. 116, 209-228 (1961).
Yeniden basım ve izinler
Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste
İzin iste