Bu biyolojik membranlar elektrik modelleri kullanarak nasıl anlaşılabilir bir gösteri. Ayrıca öğrenci yönelik laboratuarlar için kerevit ventral sinir kordonundan aksiyon potansiyelleri kayıt prosedürleri göstermektedir.
Yöntem makalesi
Devre Biyolojik Membranlar Modelleme ve Aksonlar Elektrik Sinyalleri Ölçme: Öğrenci Laboratuvar Egzersizler
Bu makalede
Özet
Özet
Bu elektriksel modelleri biyolojik membranlar karakterize etmek için nasıl kullanılabileceğini bir gösteri. Bu egzersiz aynı zamanda biyofiziksel terminoloji elektrofizyoloji kullanılan tanıtır. Aynı ekipman, canlı hazırlıkları hakkında zar modeli kullanılır. Izole bir sinir kablosunun bazı özellikleri incelenmiştir: sinir aksiyon potansiyelleri, nöronlar alımı, ve sinir kablosunu çevresel faktörlere duyarlılığı.
Protokol
1. GİRİŞ
1.1) Arka Plan
Elektrik devreleri hakkında temel bilgiye sahip olmak, fizyolojik deneylerin ve teorilerin birçok yönünü anlamak ve kavramsallaştırmak için değerli bir araçtır. Bu uygulama, voltaj kaynakları, elektriksel direnç ve elektriksel kapasitans ile ilgili bazı genel ilkeleri size tanıtmayı amaçlamaktadır. Bu giriş kavramları, sinaptik iletim ve elektrik sinyallerinin bir sinir lifi boyunca yayılması gibi fenomenleri anlamak için gerekli altyapıyı sağlar.
Bir uyarı: Metal teller ve dirençlerden oluşan standart günlük elektrik devrelerinde AKIM, negatif yüke sahip olan elektronlar tarafından taşınır. Biyolojik sistemlerde ise akım, bir veya daha fazla pozitif veya negatif yüke sahip olabilen İYONLAR tarafından taşınır. Genel kabul görmüş kurala göre akım pozitiften negatife doğru akar (gerçi elektronlar aslında ters yönde hareket eder).
Devre bileşenleri, canlı dokunun elektriksel özelliklerini ve bazı durumlarda çalışmaya dahil olan cansız nesnelerin (elektrotlar gibi) özelliklerini temsil eder.
Alıştırmayı yaparken sonuçları ve hesaplamaları not edin.
1.2) Genel İlkeler
Doğru akımın aktığı elektrik devrelerinin temel özellikleri Ohm Kanunu ile açıklanır
V = IR
Burada V = volt cinsinden gerilim (V)
I = amper cinsinden akım (A)
R = ohm cinsinden direnç (Ω)
Bu yasa, sinir hücrelerinde elektrotlarla gözlemlenen potansiyelleri düzenler. Öncelikle Ohm Kanunu'nu ve biyolojik materyallerdeki uygulamasını göstereceğiz.
1.3) Materyaller
| Öğe | Miktar |
| Breadboard | 1 |
| Dirençler: 330 K Ω | 1 |
| : 100 K Ω | 12 |
| : 33 K Ω | 6 |
| : 22 K Ω | 1 |
| : 10 K Ω | 6 |
| : 4.7 K Ω | 1 |
| : 2.2 K Ω | 1 |
| : 1.5 K Ω | 1 |
| : 1 K Ω | 1 |
| : 510 Ω | 1 |
| : 330 Ω | 1 |
| : 220 Ω | 1 |
| : 150 Ω | 1 |
| : 100 Ω | 1 |
| Kapasitörler: 0.1 μF | 6 |
| : 10 μF | 6 |
| Kablolar | 12 |
| PowerLab | 1 |
| PowerLab Çıkış Kabloları | 1 |
| PowerLab Giriş Kabloları | 1 |
| Voltmetre (Akım Ölçebilen) | 1 |
Direnç Kodlama Anahtarı
| Renk | Rakam |
| Siyah | 0 |
| Kahverengi | 1 |
| Kırmızı | 2 |
| Turuncu | 3 |
| Sarı | 4 |
| Yeşil | 5 |
| Mavi | 6 |
| Menekşe | 7 |
| Gri | 8 |
| Beyaz | 9 |
| Gümüş | %10 Tolerans |
| Altın | %5 Tolerans |
1.inci Bant - 1.inci Rakam
2.inci Bant - 2.inci Rakam
3.üncü Bant - Sıfır Sayısı
4.üncü Bant - Tolerans
Şekil 1: Sistem Kurulumu. Bilgisayar, breadboard ve çıkış stimülatörlü güç laboratuvarı.
Bu deneyde voltaj kaynağı olarak PowerLab sistemi (AD Instruments, Avustralya'dan PowerLab arayüzü) kullanılacaktır. PowerLab'in USB kablosunu bilgisayara bağlayın, PowerLab'i açın ve masaüstünden LabChart programını başlatın. "New File" seçeneğini belirleyin. Birden fazla kayıt kanalının bulunduğu bir pencere açılacaktır. Üst kısımdan "Setup" seçeneğini belirleyip "Channel Settings" kısmına tıklayın. Pencerenin sol alt köşesinden kanal sayısını (Number of Channels) 1'e düşürün; Kanal 1'deki aralığı (Range) 5 V olarak değiştirin. İki adet mini kanca uca sahip Stimülatör kablosunu PowerLab üzerindeki Output portlarına bağlayın: Kırmızı konnektör kablosunu pozitif Output portuna, siyah konnektör kablosunu ise negatif Output portuna takın. Ardından, PowerLab'in güç çıkışını, frekansını ve puls süresini değiştirmek gerekir. Bunu yapmak için "Setup" ve ardından "Stimulator Panel" seçeneklerini belirleyin. Deneyin ilk bölümü için 1.5 V'luk uzun pulslar gereklidir, bu nedenle genliği (amplitude) 0.75 V olarak ayarlayın; bu işlem 1.5 V'luk bir aralık sağlayacaktır (PowerLab, pozitif ve negatif 0.75 V arasında dalgalanan bir voltaj yayacaktır). Frekansı (0.5 Hz) ve puls süresini (1 s) ayarlayın.
Şekil 2: Breadboard şemaları. Yanlardaki renkli şeritlerin her biri, belirli bir renk için tek bir birim olarak birbirine bağlıdır. Merkezdeki 2 yatay sütun, belirli bir satır için her iki yarıda birbirine bağlıdır, ancak orta hattı veya yan şeritleri geçmezler. Ortadaki her satır, bir sonraki satırdan bağımsızdır.
Bir breadboard kullanılırken, giriş ve çıkış uçları için her iki yanda iki sütun bulunur. Pozitif uç, genellikle sütundaki tüm boşlukların birbirine bağlı olduğu sağdaki pozitif sütuna bağlanır. Negatif giriş, breadboard'un karşı tarafına bağlanır; burada da yine bir sütundaki tüm boşluklar birbirine bağlıdır. İki sütun setinin ortasında, her biri diğerlerinden bağımsız olan beş hücreli çok sayıda sıra bulunur. Beşli bir sıradaki tüm hücreler birbirine bağlıdır ancak diğer sıralardan izoledir. Şekil 2'ye bakınız. Vurgulanan bölgeler, breadboard'un hangi kısımlarının birbirine bağlı olduğunu göstermektedir. Breadboard kullanımıyla ilgili yararlı bir video http://www.youtube.com/watch?v=oiqNaSPTI7w&feature=related adresinde çevrimiçi olarak bulunabilir.
Egzersiz 1
Aşağıdaki devreden geçen AKIMI hesaplamak için Ohm Kanunu'nu kullanın:
Akım (Devre 1): ________________A
Alıştırma 2
Yukarıdaki devredeki (Devre 1) direnç üzerindeki voltajı, direncin değerini ve devreden geçen akımı ölçünüz.
Şekil 3: Wavetek Meterman voltmetresi.
1500 Ω'luk bir direnç kullanarak Devre 1'i breadboard üzerinde yeniden kurun; voltaj kaynağı (1.5 V) olarak PowerLab kullanılır. Voltaj, akım ve direnç ölçümleri Voltmetre ile yapılır. Voltmetrenin doğru veri toplayabilmesi için hem kırmızı hem de siyah probların devredeki açık tellerle temas halinde olması gerekir. Ayrıca, kadran, her bir bireysel deney düzeneğinin ölçeğine uygun bir aralıkta DC voltaja ayarlanmalıdır. Voltaj ölçümü için Voltmetrenin her iki probunu direncin iki ucuna değdirin. Direncin direncini ölçerken (voltaj düşümünü değil), voltaj kaynağının BAĞLANTISINI KESİN ve ardından her iki probu tekrar direncin uçlarına değdirin. Akımı ölçmek için Voltmetrenin devrede SERİ bağlanması gerekir; kırmızı ve siyah probların akım akışına göre uygun şekilde yönlendirildiğine dikkat edin.
Gerilim (Devre 1): ________________V
Direnç (Devre 1): ________________Ω
Akım (Devre 1): ________________A
Şimdi, tıpkı voltmetre ile yaptığınız gibi, Power Lab ile Network 2 (Network 1 ile aynı, ancak bir breadboard üzerindedir) üzerindeki voltajı ölçün. Voltmetreyi ayırın ve voltaj ölçüm probunun kırmızı ve siyah klipsli uçlarını bağlayın. Ardından, imleci kullanarak (ekranın sağ tarafındaki) "Channel 1" seçeneğine tıklayın. Tıklayıp "input amplifier" kısmına gidin. Sonra kutucuktaki "differential" düğmesine tıklayın ve aralığı 5 V olarak ayarlayın. Değişiklikleri kaydetmek için "OK" düğmesine tıklayın.
Veri toplamak için (sağ alt köşedeki) "Start" düğmesine tıklayın. Voltaj sapmalarını ölçmek için herhangi bir zamanda durdurma işlemi yapılabilir. Toplanan voltajı ölçmek için "Stop" düğmesine tıklayın, (sol alt köşedeki) "M" imlecini kullanın ve imleci sürükleyerek taban çizgisine getirin. Ardından, genliği ölçmek için serbest imleci voltaj izinin tepesine getirin. Voltajdaki değişimi (ΔV) okuyun ve verileri kağıda kaydedin. Sonuçları bağımsız bir voltmetre ile doğrulayabilirsiniz.
1.4) Seri Bağlı Direnç ve İletkenlik
Gerilim Bölücü Prensibi: Seri bağlı tüm dirençlerin toplamı üzerindeki gerilim düşümü, kaynak gerilimine eşittir. Her bir bireysel direnç üzerindeki gerilim, o direncin toplam direnç içindeki payına bağlıdır. Buna göre:
Bir çift direnç, gerilimi kendi bireysel dirençlerinin oranında bölecektir.
Egzersiz 3
Network 3'teki her bir direnç üzerindeki voltaj düşümünü hesaplayın. 1.5 V kaynağı bağlayarak, voltmetreniz ve güç laboratuvarı yazılımı ile gerçek voltajı ölçüp hesaplamalarınızı kontrol edin.
NETWORK 3. Yukarıda belirtilen iki direnci kullanın.
| Hesaplanan: | Ölçülen: |
| Gerilim (R1 üzerindeki):_______V | Gerilim (R1 üzerindeki): ________________V |
| Gerilim (R2 üzerindeki):_______V | Gerilim (R2 üzerindeki): ________________V |
1.5) Örnek Biyolojik Uygulama:
Aktif bir sinir hücresinin hücre içi ile dış çözeltisinin farklı elektriksel özellikleri, bir gerilim bölücü örneği sunar. Bu biyolojik devre, harici elektrotlarla alınan kayıtlar aracılığıyla incelenebilir. İyonların girdiği sinir hücresinin aktif bölgesi bir gerilim kaynağı gibi çalışır; akım bu bölgeden hücrenin iç kısmı boyunca akar ve dış çözelti üzerinden geri döner. Bu nedenle, potansiyelleri farklı olan membran üzerindeki iki nokta arasında, zorunlu olarak fiberin içinde olduğu kadar dışında da olan bir akım akışı mevcuttur; iç kısmın direnci dış kısmınkinden daha büyük olduğundan, en büyük gerilim düşümü burada meydana gelir.
Sistemi ve eşdeğer devresini inceleyiniz (Şekil 4: A. ve B.):
Eşdeğer Devre:
Şekil 4: A (üst). Biyolojik bir hücre membranı boyunca akımın elektriksel akışı. B (alt). Eşdeğer elektriksel devre. Voltaj kaynağı (120 mV), sinir hücresinin aksiyon potansiyeli tarafından oluşturulan transmembran voltajıdır.
Not: Güç kaynağının konumu nedeniyle R0 ve Ri aslında seri bağlıdır (paralel değil). Devrenin eşdeğer bir çizimi şöyledir:
Şekil 5: Şekil 4A için alternatif eşdeğer elektriksel devre.
Alıştırma 4.
Verilenler:
Vm, membran boyunca potansiyel = 120 mV
Ri, iç sıvının direnci = 106 Ω
R0, dış sıvının direnci = 104 Ω
A ve B elektrotları arasındaki potansiyel olan V0 değerini hesaplayınız.
V0: ________________V
Alıştırma 5.
Network 4'ü (aşağıya bakınız) kullanarak, her bir direnç üzerindeki (R0 ve Ri) potansiyelleri ölçün.
NETWORK 4. 4.7 K Ω ve 10 K Ω dirençleri 1.5 V kaynağına seri olarak bağlayın:
Voltajları Voltmetreniz ile ölçün.
Voltaj (R0 üzerinden): ________________V
Voltaj (Ri üzerinden): ________________V
AĞ 5 : R0 = 1 K Ω olması dışında Ağ 4 ile aynıdır
Ağ 5'te, dış direncin çok daha düşük olduğuna (elektrotları kısa devre yapan çok miktarda sıvı veya inaktif doku bulunmasına benzer şekilde) dikkat edin; bu nedenle dış direnci artırmak için sinirlerden hava ortamında veya yalıtkan yağ altında kayıt yapmanın önemi ortaya çıkar.
Gerilim (R0 üzerinden): ________________V
Gerilim (Ri üzerinden): ________________V
1.6) Seri ve Paralel Bağlamada Direnç ve İletkenlik
Örnek Biyolojik Uygulama:
Seri ve paralel dirençler için iyi bir örnek, kimyasal iletimli bir sinapsın elektriksel konfigürasyonudur. Sinaptik boşluğun şönt etkisi nedeniyle çoğu sinaps boyunca elektriksel iletim mümkün değildir. Ancak, bu şöntün, presinaptik membran boyunca beraberinde nörotransmiter salınımını getiren büyük bir potansiyelin gelişmesine izin vermek için muhtemelen gerekli olduğunu unutmayın.
Şekil 6: Bir sinaps üzerinden elektrokimyasal akış modeli.
Canlı dokularda, membranlarda ve kısıtlı hücre dışı boşluklarda belirgin elektriksel dirençlerin oluştuğu unutulmamalıdır. Hücre sitoplazması veya banyo çözeltileri gibi nispeten geniş sıvı boşluklar ise belirgin dirençler oluşturmazlar.
Alıştırma 6.
Ağ 6 (yukarıya ve Devre Kartına bakınız), kimyasal iletimli bir sinapsın analoğudur. Elektriksel iletimli sinapslarda, sinaptik boşluk (şönt direnci Rs) ortadan kalkar ve akım, presinaptik hücreden postsinaptik hücreye doğrudan Rm1 ve Rm2 üzerinden, ardından Rm3 üzerinden akar. Ağın zayıflaması, farklı sinapslardaki değişiklikleri örneklendirecek şekilde çeşitli direnç değerleri kullanılarak kolayca ölçülebilir. PowerLab cihazınızı 1,5V (yani 0,75 Volt ayarı) ile bağlayınız.
- Multimetreyi kullanarak, ağdaki her bir direnç üzerindeki potansiyel farkı (PD) verildiği şekilde ölçün. Direnç değerlerini kaydedin. Rm3 (postsinaptik hücrenin membranı) üzerindeki PD'yi özel olarak not edin. Voltaj: ________________V
- Rs konumundaki 330 Ω direnci 330K Ω bir dirençle değiştirin. Rm3 noktasındaki PD'yi ölçün.
- Şimdi, Rs değerini 330K Ω'da tutarak, Rm2 konumundaki 330K Ω direnci 33K Ω bir dirençle değiştirin. Rm3 üzerindeki PD'yi ölçün. Voltaj: ________________V
- Şimdi Rs değerini 330K Ω'da ve Rm2 değerini 33K Ω'da tutarak, R m1 konumundaki 22K Ω direnci 220 Ω bir dirençle değiştirin. Rm3 üzerindeki PD'yi ölçün. Voltaj: ________________V
Alıştırma 7
Seri-paralel direnç ağına bir örnek, sinir veya kas lifinin kablo özellikleri değerlendirildiğinde karşımıza çıkar. Bir lifin UZUNLUK SABİTİ, membran üzerindeki bir PD'nin orijinal değerinin %37'sine düştüğü mesafedir. Zayıflama, membranın her iki yanındaki sıvının iç ve dış dirençlerinin, (nispeten yüksek olan) transvers membran direnci tarafından kısa devre yapılmasına bağlıdır. Direnç değeri, bir sinir hücresinin aksonu boyunca sinyal iletimini sınırlar. Uzunluk sabiti, eksponansiyel bir sönümlenme için ölçüldüğünde 1/e'dir. dE/dT=-E/RC; burada E voltaj farkı, R direnç ve C kapasitanstır. Veya başka bir formda E=Eoexp (-t/RC); burada Eo başlangıç voltajı ve t saniye cinsinden zamandır. RC aynı zamanda tau (τ), yani zaman sabiti olarak da adlandırılır.
Dış sıvının direncinin hücre içi ve membran dirençlerine kıyasla ihmal edilebilir olduğu varsayıldığında, membranın pasif direnç özellikleri aşağıdaki devre ile temsil edilebilir:
Şekil 7: Ağ 7'nin breadboard düzeneğine aktarımı.
Ağ 7'nin A ve B arasındaki bir ucuna voltaj uygulayın. 1s süreli, 1V genlikli (0,5 V'a ayarlayın) ve 0,75Hz frekanslı bir pals seçerek bir stimülatör kullanın. Voltmetreyi sırayla her bir "membran" direncine bağlayın ve bu direnç üzerindeki PD değerini kaydedin. Voltmetre probunun bir ucunu (A-uçu, Kırmızı) sabit tutarken diğer ucu sırasıyla 1-5 konumları boyunca hareket ettirin. Her değeri, membran dirençleri birim mesafe uzaklıkta olacak şekilde, kaynağa olan "mesafeye" karşı PD grafiği üzerinde işaretleyin. Grafiğinizden bu devrenin uzunluk sabitini belirleyin. 
Ağ 7 Uzunluk Sabiti Grafiği:______________
Miyelin kılıfı ile meydana gelebileceği gibi transvers membran direncinin artmasının veya fiber çapındaki artışla ilişkili olarak fiberin longitudinal iç direncinin azalmasının etkisi, uzunluk sabitindeki bir değişimdir. Dirençlerin değerleri, bir sinir aksonunda gerçekte bulunanlar değildir, ancak yaklaşık olarak orantılıdır. Benzer şekilde, model üzerindeki "birim mesafe", gerçek bir sinir hücresine göre önemli ölçüde ölçeklendirilmiştir.
1.7) Kapasitans
Kondansatörler yük depolar. Bir kondansatöre bir direnç üzerinden voltaj uygulandığında, kondansatöre doğru akım akar ve ardından kondansatör üzerindeki PD (potansiyel fark), kaynak PD'sine doğru zamanla eksponansiyel olarak yükselir; bu voltaj değişiminin zaman seyri, uygulanan voltaja, kapasitansa ve seri dirence bağlıdır. Bir kondansatör boşaldığında benzer ancak ters yönlü bir zaman seyri görülür.
Bu basit Direnç-Kapasitans (RC) ağının girişini A ve B noktalarından stimülatörünüze bağlayın. 1s süreli ve 0.75Hz frekanslı 1V (0.5V'a ayarlanmış) darbeler kullanın. Ayrıca, veri toplama hızını 20 K /sec olarak ayarlamanız gerekir (panelin sağ tarafı). PowerLab giriş klamplerini kondansatör uçlarına bağlayın. Birkaç saniye boyunca veri toplayın ve ardından durdurun. Kare darbelerden birindeki yükselme süresini genişletmek için Zoom penceresini kullanın. İzi yaymak için yakınlaştırma işleminin birkaç kez tekrarlanması gerekebilir. Baz çizgiden, voltaj izinin düzleştiği noktadaki tepeye kadar olan yükselme süresini ölçün. Potansiyel değişiminin zaman seyrini ve kare darbelerin bozulmasını gözlemleyin. 10μF kondansatörü 0.1 μF olanla değiştirmenin etkisini gözlemleyin. PowerLab voltaj probunuzu direnç uçlarına bağlayarak, devre üzerinden akım akışının zaman seyrini gözlemleyebilirsiniz. Sadece birkaç darbe toplayın ve ardından ölçüm yapmak için durdurun. Yükselme öncesindeki baz çizgisine gitmek için "M" imlecini, voltajın düzleşmeye başladığı yere gitmek için ise serbest imleci kullanın.
Son örnek hem dirençli hem de kapasitif bileşenleri içermektedir. Sinir ve kas liflerinin pasif kablo özellikleri, hücre membranı özelliklerinden kaynaklanan benzer elementler tarafından belirlenir. Hücrede sadece enine bir membran direnci bulunmakla kalmaz, aynı zamanda hücre membranının elektriksel özellikleri nedeniyle bir membran kapasitansı da mevcuttur. Bunun etkisi, elektrotonik olarak yayılan potansiyellerin gelişme süresini etkilemektir.
Örnek:
Bu ağ, gerekli kapasitörlerin membran dirençlerine (Rm) paralel olarak bağlanmasıyla Ağ 7'den oluşturulabilir.
Alıştırma 8.
10 μF kapasitörleri Ağ 7'ye bağlayın. A ve B noktalarına bağlanması gereken stimülatörden 1s, 1V (0.5 V ayarı) ve 0.75Hz impulslar kullanarak, her bir membran direnci üzerindeki potansiyel değişimlerini gözlemleyin. "Eşik" voltajının (bir sinir hücresinde aksiyon potansiyelinin oluştuğu voltaj) 0.2V olduğunu varsayarak, potansiyelin her bir membran direncinde eşik değere ulaşması için geçen süreyi ölçün. Buradaki eşik, canlı bir hücrede aksiyon potansiyelinin oluşturulabileceği potansiyel değerini ifade eder. Sonuçlarınızı 'mesafe'ye karşı zaman grafiği olarak çizin.
Şekil 8: Ağ 9'un breadboard düzeneğine aktarımı.
Şekil 8 için Grafik.
Miyelin kılıf kalınlığındaki artışın neden olduğu membran kapasitansındaki azalmanın etkisini, daha küçük 0.1μF kapasitörlerle değiştirerek simüle edin. Seçilen bir dirençte eşik değere ulaşma süresindeki değişimi not edin. Verileri, daha büyük kapasitörlerin yer aldığı aynı grafik üzerine üst üste ekleyin.
Kas membranı açısından bakıldığında, ilişkili T-tübüllerinin membran yüzey alanını artırması nedeniyle kapasitansın arttığı ve bunun sonucunda bir nörona kıyasla daha büyük bir membran kapasitansı oluştuğu düşünülebilir. Miyelinsiz bir sinir aksonuna miyelin eklenmesi sonucu meydana gelen kapasitans azalmasını örneklendirmek için daha küçük kapasitörler kullanılabilir. Burada öğrenilmesi gereken temel nokta, elektriksel kapasitansın yüzey alanı ile doğru orantılı, kapasitörün "plakalarını" veya depolama yüzeylerini birbirinden ayıran dielektrik tabakanın (miyelin) kalınlığı ile ters orantılı olduğudur.
Model bir devre üzerinde sunulan özellikler, canlı preparatlarda gözlemlenir. Ancak hücreler, membran boyunca sızıntı ve aksiyel direnç gibi özellikler bakımından farklılık gösterir. Bazı hücreler aksiyon potansiyeli oluşturmaz. Bununla birlikte, hücrelerin pasif elektriksel özellikleri sinyalleri birkaç milimetre boyunca zayıflattığı için, bir sinyalin birkaç milimetre öteye iletilmesi gerektiğinde bir aksiyon potansiyeli üretilir. Bir sonraki deneyler serisinde, aksiyon potansiyellerinin kaydedilmesi gösterilmektedir.
1.8) Öğrenciler için sorular
- Nöronlar ve kas hücreleri için uzunluk sabitinin bazı normal değerleri nelerdir?
- Bir membranın düşük membran direncine sahip olması durumunda, zaman sabiti (final değerin %63'üne ulaşma süresi) değişir mi? Eğer değişiyorsa, daha düşük bir membran direnciyle nasıl değişir? Zaman sabiti (tau) için genel matematiksel formül nedir?
- Mürekkep balığı dev aksonu gibi daha büyük aksonlar, aynı mürekkep balığı preparasyonundaki daha küçük aksonlara göre elektriksel sinyalleri neden daha hızlı iletebilir?
2. SİNİR HÜCRELERİNİN İLETİM ÖZELLİKLERİ
2.1) Devre tahtasından canlı hücrelere
Devre kartı egzersizlerinde gösterilen pasif özellikler canlı hücrelerde de ölçülebilir; ancak bu pasif özellikleri, sinir hücrelerindeki aksiyon potansiyelleriyle birlikteyken ayırt etmek karmaşık olabilir. Nöronun aktif özellikleri; dinlenim membran potansiyelini koruma, aksiyon potansiyelleri oluşturma ve bunları membran boyunca yeniden üretme yetenekleridir.
Bir sinir kordonu boyunca gerçekleşen elektriksel akış, tekil nöronlar içinde ve bir nöronun bir sonrakine aktarımı şeklinde rejeneratif de olabilir. Istakoz ventral sinir kordonunda (VNC), bazı nöronlar septat (yani gap) eklemler aracılığıyla iletişim kurar. Bread board ile yapılan önceki egzersizlerde gösterildiği gibi, direncin değiştirilmesi elektriksel sinyallerin iletimini engelleyebilir. Bu durum, ventral sinir kordonu içindeki gap eklemlerinden geçen akımın değiştirilmesine benzer.
VNC'deki bileşik aksiyon potansiyelinin iletim hızı ve diğer özellikleri bir sonraki deney serisinde incelenmektedir. VNC'nin deneyler için nasıl elde edileceğini ve öğrenci laboratuvarlarının eğitimi için tasarlanmış standart ekipmanlar kullanılarak yanıtların nasıl uyarıldığını ve ölçüldüğünü göstereceğiz.
2.2) Kerevit preparasyonu
Kerevit ventral sinir kordonu bu deney için en uygun olanıdır. Sinir kolayca diseke edilebilir ve iletimi etkileyen çeşitli protokoller bu preparatla kullanılabilir. Bu deneye başlamadan önce, aşağıdaki kerevit anatomi terimlerine aşina olun:
Şekil 9. Genel kerevit anatomi diyagramı.
Şuradan uyarlanmıştır: http://www.enchantedlearning.com
2.3) Bir sinirdeki iletim hakkında temel bilgiler
Kerevit ventral sinir kordonu, kuyruk çarpma reaksiyonu gibi kaçış yanıtlarını başlatan sinyallerin iletiminde görev yapar. Bu deneyde, kayıtlar tamamen sağlam olan sinir kordonundan alınacaktır. Sinir kordonu içindeki her bir nöronun bireysel potansiyelleri, kayıt yazılımı tarafından gösterilen ölçülebilir elektriksel darbeleri sağlayan bileşik aksiyon potansiyelini oluşturmak üzere toplanır. Erlanger, Gasser ve Bishop (1924), bileşik aksiyon potansiyellerini tanımlayan öncüler arasındadır. Refrakter dönem özellikleri, iletim hızı ve gap junction inhibitörü 1-heptanol veya sıcaklığın nöral etkileri gösterilmektedir. Sinir hücresi sinyallerinin temel ilkelerini öğrenmek, genel olarak nörolojik fonksiyonların daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunur (Bennett, et al., 1991; Furshpan et al., 1959; Watanabe and Grundfest, 1961).
2.4) Materyaller
| Öğe | Miktar |
| Büyük Kerevit (Procambarus clarkii) | 1 |
| Hassas Diseksiyon Makası | 1 |
| Pens | 1 |
| MLT016/X Sinir Odası | 1 |
| Scope yazılımlı dizüstü bilgisayar | 1 |
| PowerLab | 1 |
| PowerLab Amplifikatörü | 1 |
| PowerLab için stimülatör çıkış kablosu | 1 |
| USB PowerLab/Bilgisayar Konnektörü | 1 |
| Vakum Elektrotlu Manipülatör Standı | 1 |
| Pompalı cam pipet | 1 |
| Kerevit Salin Beheri | 1 |
2.5) Yöntemler
2.5.1) Diseksiyon
Bir kerevizi diseke etmeden önce sinir kabının, çeşitli aletlerin ve solüsyonların hazır olduğundan emin olun.
- Kereveti tutmak için nemli bir kağıt havluya sarın veya kıskaçlarını (chelipeds) başparmağınız ile işaret parmağınız arasında tutarak tek elinizle kavrayın.
- Diğer elinizi kullanarak, göz çukurları arasındaki rostrum üzerinden makasla bir insizyon yapın.
- Baş tamamen ayrılana kadar insizyondan aşağıya doğru kesin.
- Sefalotoraksın tabanında, abdomenin üzerinde bir insizyon yapın; kuyruğu çıkarın. (Gerekirse, bu işlemi kolaylaştırmak için chelipedler ve yürüyüş bacakları çıkarılabilir.)
- Yüzücü ayakları (swimmerets) çıkarın.
- Abdomenin ventral tarafının her iki yanından bir kesik atın. Daha derin dokulara zarar vermemeye dikkat edin.
- Ventral sinir kordunu açığa çıkarmak için ekzoskeletin serbest kalan kısmını kuyruk yelpazesinin tabanına kadar soyun.
- Pensin ucunu kullanarak ventral sinir kordunu uç kısmından dikkatlice çıkarın. Sinir kordunu germemeye veya ezmemeye dikkat edin. (Sinir kordu üzerinde gözlemlenen nodüller kerevet ganglionlarıdır.)
- Sinir kordunu sinir odasındaki metal çubukların üzerine yerleştirin. Ventral sinir kordunun nemli tutulması zorunludur. Bunu başarmak için, sinir odasına metal yatay çubukların seviyesine ulaşacak kadar kerevet salin solüsyonu ekleyin. Ardından, sıvının seviyesi çubukların altına sadece temas edecek şekilde kerevet salin solüsyonunu pipetle çekin.
Kerevet Salini (mM: 205 NaCl; 5.3 KCl; 13.5 CaCl2.2H2O; 2.45 MgCl2.6H2O; pH 7.4'e ayarlanmış 5 HEPES) - Sinir yerleştirildikten sonra, iki mini kanca uca sahip stimülatör kablosunu sinir odasına bağlayın. Pozitif kırmızı ucu, sinir kordunun ucuna yakın dış metal halkalardan birine; negatif siyah ucu ise sinir korduyla hala temas halinde olan en yakın bitişik metal halkaya bağlayın.
- Vakum elektrodunu, manipülatör içinde sinirin karşı ucuna yakın bir konuma yerleştirin.
- Ventral sinir kordunun ucunu dikkatlice kayıt elektroduna vakumlayarak çekin.
2.5.2) Kayıt
Sinir kordonunun ucu kayıt elektroduna vakumla çekildikten sonra, elektrodun proba bağlı olduğundan ve probun yeterince topraklanmış olduğundan emin olun. Bu, toprak kablosunun basitçe Faraday kafesine bağlanmasıyla gerçekleştirilebilir. Pozitif ve negatif vakum elektrot kabloları da prob üzerindeki karşılık gelen konumlara bağlanmalıdır. Prob, PowerLab'e bağlı olan diferansiyel amplifikatöre bağlanmalıdır.
Vakum elektrodundan gelen elektrik kablolarını kafa katına (head stage) bağlayın. Kablolar; sol üstte kırmızı (pozitif), ortada yeşil (toprak) ve altta siyah (negatif) olacak şekilde bağlanmalıdır. Bu durum, aşağıdaki kafa katı için Şekil 10'da gösterilmiştir. Toprak kablosu doğrudan salin banyosuna yerleştirilebilir. Böylece, vakum elektrodundan gelen kablolardan biri + girişine, diğeri ise - girişine bağlanır. Vakum elektrodundan gelen hangi kablonun + veya - girişlerine bağlanacağı fark etmez.
Şekil 10: Kafa katı girişleri
Amplifikatör ayarları şu şekildedir:
| KONTROL | AYAR |
| Yüksek Geçiren | DC |
| Çentik Filtre | KAPALI |
| Alçak Geçiren | 20kHz |
| Kapasite Komp. | Saat Yönünün Tersine |
| DC Ofset Hassas ve Kaba ayar düğmesi | Saat Yönünün Tersine |
| DC Ofset (+KAPALI) | KAPALI |
| Kazanç düğmesi | 50 |
| Giriş (DIFF MONO GND) | DIFF |
| MOD(STIM-GATE-REC) | GATE |
| ΩTEST | KAPALI |
Sağlanan USB kablosunu PowerLab'ın arkasına ve bilgisayar çıkışına bağlayın. Bilgisayar masaüstündeki Scope yazılımını açın. Ekranın sağ üst kısmında "Channel 2"yi seçin ve kapatın. Ekranın ortasındaki çubuğu aşağı kaydırarak yalnızca Kanal 1 görünecek şekilde ekranı ayarlayın. Ardından, ekranın sağ üst kısmında kanal 1 için "Input Amplifier" seçeneğine tıklayın. Şunları seçin:
| KONTROL | AYAR |
| ARALIK | 500 mV |
| AC | İŞARETLİ |
| ALÇAK GEÇİREN | KAPALI |
| TEK UÇLU | İŞARETLİ |
| TERSLE | İŞARETLİ |
Ardından, yine "Set up" başlığı altında "Sampling" seçeneğine tıklayın. Açılan ekrandaki "Sweep" başlıklı kutucukta şunları seçin:
| KONTROL | AYAR |
| MOD | ÇOKLU |
| ÖRNEK | 100 TARAMA |
| KAYNAK | KULLANICI |
| GECİKME | 0 SANİYE |
Son olarak, "Set up" sekmesi altında "Stimulator" seçeneğini belirleyin. "Isolated Stim" özelliğini kapatmak için kutucuğa tıklayın. Aşağıdaki ayarları seçin:
| KONTROL | AYAR |
| MOD | ÇOKLU |
| GECİKME | 5 ms |
| SÜRE | 1 ms |
| PULS(LAR) | 2 |
| ARALIK | 15 ms |
| ARALIK | 5 V |
| GENLİK | 0.5 |
Sağ panelde yer alan "Time Base" kısmına bakın. "Sample" değerini 1024, "Time" değerini ise 200 msec olarak değiştirin.
Şekil 11: Scope yazılımı ile kaydedilen, uyaranlar arasında 15 msec aralık bulunan iki bileşik aksiyon potansiyeli.
Alıştırma 1.
Ekranın sol alt köşesindeki "Start" düğmesini seçin. Yukarıdaki ayarlar verildiğinde, Scope veri toplama kutusunda net bir şekilde tanımlanmış bir bileşik aksiyon potansiyeli görünmelidir (Şekil 11). Aksiyon potansiyelinin genel şeklini aşağıdaki grafiğe çizin (Şekil 12):
Şekil 12: Bileşik aksiyon potansiyelinin şeklinin çizileceği boş grafik.
Ekranın sol üst köşesindeki sekme를 kullanarak voltajı yavaşça düşürün. Aksiyon potansiyelinin büyüklüğü, karakteristik dalga formu da kaybolana kadar küçülmelidir. Voltajın düşürülmesi, bileşik aksiyon potansiyelini oluşturmak için devreye giren nöron sayısını azaltır. Daha büyük aksonların düşük voltajlarda devreye girmesi muhtemeldir ve bunlar, bileşik aksiyon potansiyelinde ilk olarak görülme eğiliminde olan daha hızlı iletime sahip aksonlardır. Ters etkiyi gözlemlemek için voltajı kademeli olarak artırın; daha fazla nöron devreye girdikçe, bileşik aksiyon potansiyeli dalgası büyür. Bu uygulama, bireysel nöronların aksiyon potansiyeli oluşumu için farklı eşik değerlerine sahip olduğu gerçeğini göstermektedir. Uyarıcı voltaj artırılmasına rağmen bileşik aksiyon potansiyeli artık artmadığında, tüm nöronlar devreye girmiş demektir; bu durumda bilgisayar ekranındaki aksiyon potansiyeli dalgasında iki belirgin pik görülmelidir.
Alıştırma 2.
Nöron katılımını ve bunun sonucunda oluşan bileşik aksiyon potansiyelini inceledikten sonra, refrakter dönemin etkisini gözlemleyin. Bu işlem, zaman olarak birbirine yakın iki uyaran verilerek ve uyaranlar arası aralık değiştirilerek gerçekleştirilebilir; ardından, ikinci uyaran tarafından tetiklenen bileşik aksiyon potansiyelinin genliğinin, ilk bileşik aksiyon potansiyeline kıyasla hangi uyaranlar arası aralıkta azaldığı gözlemlenir. Ekranın sol üst köşesindeki sekmeyi kullanarak darbeler arasındaki gecikmeyi değiştirin. İkinci bileşik aksiyon potansiyeli tetiklenemeyene kadar gecikmeyi kısaltmaya devam edin. İkinci bir aksiyon potansiyelinin artık tetiklenmediği darbeler arası süre, mutlak refrakter dönemdir. Mutlak refrakter dönemin sonu ile ikinci bir uyaranın tam genlikte bir aksiyon potansiyeli oluşturduğu süre arasındaki zaman ise relatif refrakter dönem olarak adlandırılır. Belirtilen boşluklara mutlak ve relatif refrakter dönemler için bir tahmin yazın.
Mutlak Refrakter Dönem: ___________________
Relatif Refrakter Dönem: ___________________
2.5.3) İletim hızının ölçülmesi
Milimetrik bir cetvel ile, kayıt elektroduna en yakın olan stimülasyon teli ile kayıt elektrodu arasındaki mesafeyi ölçün. Bileşik potansiyeldeki olayların çeşitli piklerine kadar geçen süreyi, çeşitli elektriksel sinyallerin iletim hızını kaydedebilmek için kaydedilen iz üzerinden ölçün. Birimlerin metre/saniye olması için mm cinsinden mesafeyi metreye, msec cinsinden süreyi ise saniyeye dönüştürün.
1.inci dalga formu iletim hızı: __________________
2.nci dalga formu iletim hızı: __________________
3.üncü dalga formu iletim hızı: __________________
4.üncü dalga formu iletim hızı: __________________
2.5.4) Gap bağlantılarının ve/veya iletim hızının manipülasyonu
Ardından, nöronal bir inhibitörün özelliklerini inceleyin. Heptanolün ayrıştırma etkisi, ilk olarak Johnston et al. (1980) tarafından kerevit septalı aksonlarında (yani gap junction'larda) tanımlanmıştır. Elektriksel iletişimle ilgili olan bu etki, kısa süre sonra çeşitli omurgalı ve omurgasız sistemlerde onaylanmıştır (Bernardini et al., 1984; Meda et al., 1986). Bu ventral sinir kordundaki elektriksel iletişimin rolünü anlamak için, gap junction'ları ayrıştırmak amacıyla (1mM) 1-heptanol içeren bir salin kullanılabilir. Bir cam pipet yardımıyla, tüm sinir kordu üzerine heptanol çözeltisi yıkayın. Scope kayıt yazılımı tarafından kaydedilen değişikliği gözlemleyin ve özetleyin. (Dalga formundaki değişime ve dalga formlarının iletim hızının değişip değişmediğine dikkat edin). Alternatif olarak, 1-heptanol kullanmak yerine, banyo salini buz gibi soğuk salin ile değiştirilebilir ve dalga formunda veya dalga formlarının iletim hızındaki herhangi bir değişiklik izlenebilir.
Tartışma
On-line video sunum ve bu yazıda amacımız hücrelerinin biyofiziksel özellikleri, kısmen, elektrik devreleri olarak modellenmiş olduğunu göstermektir. Buna ek olarak, nispeten daha kolay elde edilir canlı sinir dokusu ile, mütevazı bir ekipman yatırımları ile lisans öğrencisi laboratuarlar için iletim hızı, refrakter, dönemlere ve elektrofizyolojik kayıt teknikleri temel ilkeleri mümkündür. Temalar ve sunulan temel paradigmalar farklı derslerin gereksinimleri için kolayca değiştirilebilir.
Kerevit ve bolluk Bakım öğrenci odaklı bir deney için, onları çekici modelleri kılar. Kabuklu ventral sinir kabloları genellikle sağlam ve 3 saatlik bir öğrenci laboratuar için yeterli olan en az bir saat boyunca tuzlu su, fizyolojik bütünlüğünü korumak.
Kerevit VNC büyük akson bazı standart kurbağa siyatik sinir hazırlanmasında bulundu gösterilenden daha gap junction, katkılarının ek deney yapılabilir ve farklı özellikleri ile bağlı olduğu göz önüne alındığında. Siyatik siniri bileşik aksiyon potansiyelleri ve iletim özellikleri adresleme için klasik bir model. Hatta ilginç bir karşılaştırmalı iletim özelliklerini karşılaştırmak için öğrenciler için deney, akson işe alım ve bu iki hazırlıkları arasında refrakter dönemler olabilir.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Bu deneyler, bir kursta kullanılan bir laboratuvar kılavuzu, Toronto Üniversitesi, Zooloji Anabilim Dalı, Dr. HL Atwood tarafından yönetilen modifiye edilmiştir. Egzersizleri de kullanılan ve "ON TEMEL SİNİRBİLİM 6. YOĞUN IBRO ÇALIŞTAYI" için üretildi ve 1993 (Cooper ve ark, 1993), Kore Üniversitesi, Seul, Güney Kore'de düzenlenen bir kılavuz değiştirilmiş . Mevcut değişiklikler, çeşitli üniversitelerde, gün öğrenci yönettiği laboratuarları sunmak ortak ekipman kullanımı için gerekli. Kentucky Üniversitesi, Biyoloji Bölümü, Lisans ve College of Arts & Sciences Ofisi tarafından desteklenir.
Malzemeler
Devre kartı
- Breadboard deneyler için aşağıda listelenmiştir Elektronik, Radio Shack gibi bir yerel elektronik mağazasından elde edilebilir.
- Ekmek tahtası, dirençler, kapasitörler, piller ve teller deneyler belirtildiği gibi breadboard için kavşak olarak hizmet verebilir.
- Ortak bir voltmetre (Wavetek Meterman voltmetre)
- A / D kurulu bir bilgisayar line kayıt için. Elektrik sinyalleri, bir PowerLab/4s arayüz (ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA) hattı üzerinde kaydedilir. Grafik veya Kapsam adlı ADInstruments standart yazılım kullanın.
Fizyoloji deneyler
- Kerevit (Procambarus clarkii). Atchafalaya Biyolojik Supply Co, Raceland, LA, ABD.
- Standart kerevit salin: Van Harreveld çözümü (1936) modifiye edilmiştir. (MM) 205 NaCl; 5.3 KCl; 13.5 CaCl 2 2H 2 O; 2.45 MgCl 2 6H 2 O 5 Hepes ve pH 7.4 'e ayarlanır. Tüm tuzlu su kimyasalları, Sigma kimya şirketi (St. Louis, MO) elde edilmiştir.
- Diseksiyon araçları: # 5 cımbız Güzel, ince makas, bıçak tutucu, # 26.002-20 böcek pimleri (Güzel Bilim Araçları (USA), Inc, 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94.404-1139 elde)
- Bir sinir odası sinir tutmak için çanak (ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA). Sinir odası çanak ile gelen telleri siniri uyarmak için kullanılabilir.
- Emme elektrot sinyallerini kaydetmek için kullanılır.
- Manipülatör veya bir halka standında bir kelepçe de emme elektrot için tutucu olarak görev yapacak.
- Faraday Kafesi
- Diseksiyon Mikroskop
- Yüksek Yoğunluklu Aydınlatıcı (ışık kaynağı)
- Mikroskop Platformu
- AC / DC Diferansiyel Amplifikatör (AM Systems Inc Model 3000)
- PowerLab 26T (AD Aletleri)
- Ekstrasellüler amplifikatör (AD Aletleri)
- LabChart 7 (ADI Aletleri)
- Diseksiyon araçları
- Halka stand ve kayıt emme elektrot için tutucu olarak hizmet vermeye kelepçe
Kaynaklar
- Bennett, M. V. L., Barrio, L. C., Bargiello, T. A., Spray, D. C., Hertzberg, E., Sdez, J. C. Gap junctions: new tools, new answers, new questions. Neuron. 6, 305-320 (1991).
- Bernardini, G., Peracchia, C., Peracchia, L. L. Reversible effects of heptanol on gap junction structure and cell-to-cell electrical coupling. European Journal of Cell Biology. 34 (2), 307-312 (1984).
- A report on the, "SIXTH INTENSIVE IBRO WORKSHOP ON BASIC NEUROSCIENCE". Cooper, R. L., Chang, J. J., Ito, M. July 1993, Seoul, South Korea, , Society for Neuroscience. 116-116 (1985).
- Cragg, B. G., Thomas, P. K. The relationship between conduction velocity and the diameter and internodal length of peripheral nerve fibers. Journal of Physiology. 136, 606-614 (1957).
- Erlanger, J. G. asser, S, H., Bishop, G. H. The compound nature of the action current of nerves as disclosed by the cathode ray oscillograph. American Journal of Physiology. 70, 624-666 (1924).
- Furshpan, E. J., Potter, D. D. Transmission at the giant motor synapses of the crayfish. Journal of Physiology. 145 (2), 289-325 (1959).
- Johnston, M. F., Simon, S. A., Ramrn, F. Interaction of anesthetics with electrical synapses. Nature (Lond). 286, 498-500 (1980).
- Loewenstein, W. R. Permeability of membrane junctions. Annual NY Academy of Sciences. 137, 441-472 (1966).
- Meda, P., Bruzzone, R., Knodel, S., Orci, L. Blockage of cell-to-cell communication within pancreatic acini is associated with increased basal release of amylase. Journal of Cell Biology. 103 (2), 475-483 (1986).
- Peracchia, C. Increase in gap junction resistance with acidification in crayfish septate axons is closely related to changes in intracellular calcium but not hydrogen ion concentration. Journal of Membrane Biology. 113 (1), 75-92 (1990).
- Peracchia, C., Dulhunty, A. F. Low resistance junctions in crayfish: structural changes with functional uncoupling. Journal of Cell Biology. 70, 419-439 (1976).
- Peracchia, C., Bernardini, G., Peracchia, L. L. Is calmodulin involved in the regulation of gap junction permeability. Pfügers Arch. 399, 152-154 (1983).
- Peracchia, C., Lazrak, A., Peracchia, L. L. Molecular models of channel interaction and gating in gap junctions. Handbook of Membrane Channels. Molecular and Cellular Physiology. Peracchia, C. , Academic Press. San Diego. 361-377 (1994).
- Spray, D. C., Harris, A. L., Bennett, M. V. L. Gap junctional conductance is a simple and sensitive function of intracellular pH. Sciences NY. 211, 712-715 (1981).
- Spray, D. C., Harris, L. L., Bennett, M. V. L. Comparison of pH and Ca dependence of gap junctional conductance. Intracellular pH: Its Measurement, Regulation, and Utilization in Cellular Functions. Nuccitelli, R., Deamer, D. , Alan R. Liss. New York. 445-461 (1982).
- Spray, D. C., White, R., De Carvalho, C., Harris, A. L., Bennett, M. L. V. Gating of gap junction channels. Journal of Biophysics. 45, 219-230 (1984).
- Watanabe, A., Grundfest, H. Impulse propagation at the septal and commissural junctions of crayfish lateral giant axons. Journal of General Physiology. 45, 267-308 (1961).
- Wiersma, C. A. G., Hughes, G. M. On the functional anatomy of neuronal units in the abdominal cord of the crayfish, Procambarus clarkii. Journal of Comparative Neurology. 116, 209-228 (1961).
Yeniden basım ve izinler
Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste
İzin iste