$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Reaktiflerin hazırlanması
Ca olmadan bir bölümünü 10X HBSS Percoll 9 parça karıştırılarak stok izotonik Percoll (SIP), beyin başına 4 ml, hazırlama + + ve Mg + +.
1X HBSS% 70 olmadan SIP hazırlayın Ca + + ve Mg + +, 2 ml, 15 ml polipropilen konik tüp boşaltılan beyin başına.
Not: Percoll oda sıcaklığında kullanılması gerektiğini tavsiye edilir, soğuk kullanılması halinde, hücreler gelme eğilimindedirler ve hücre ayırma, daha az verimli.
Doku toplama ve homojenizasyon
Buz 1X HBSS ile sol ventrikül ile fareler ve serpmek anestezisi. Beyin ve omurilik inceleyin ve fenol kırmızısı kadar tüm fareler kurban olmadan RPMI korumak.
7 veya 15 ml Dounce homojenizatör 3 ml RPMI içeren Yeri dokular, nazikçe, dokulara daha fazla ayırmak tigh uydurma havaneli (B boyutu) tarafından takip gevşek havaneli (A boyutu) ile bir hücre süspansiyonu olun. RPMI hücre süspansiyonları ile 7 ml hacmi tamamlayın.
Gradient kurdu
Final% 30 SIP yapmak için SIP 3 ml hücre süspansiyonu
Yavaş yavaş tabaka,% 70 SIP üstünde 10 ml hücre süspansiyonu. Bu prosedürün en kritik adım,% 70 karıştırma ve% 30 çözümleri kaçınarak çekim modunda bir pipet yardımı kullanın. Çok net bir düz hat 70% -30% kavşakta görünür olmalıdır.
500G 18 ° C'de 30 dakika santrifüjleyin Santrifüj interfaz rahatsız değildir, böylece az ya da hiç fren duracaktır emin olun.
Bir transfer pipetlemeyin kullanarak, yavaşça tüpün üst katman enkaz kaldırmak ve 8 ml 1X HBSS içeren temiz bir konik tüp içine 70% -30% interfaz 2.0-3.0 ml toplamak. Interfaz içeren Percoll yaklaşık üç kat sulandırılmış olduğundan emin olun, 18 500G inversiyon ve centrifugre 7 dk birkaç kez karıştırın ° C.
Yeniden süspanse hücre boyama tampon 1 ml pelet ve 1.5 ml tüp aktarmak ve bir mikro-4 10.000 G 1 dak ° C santrifüj kullanarak bir kez daha yıkayın
Antikor boyama
Antimouse CD16/CD32 saflaştırılmış 50 ul yeniden süspanse pelet Fc'yi siteleri engellemek için hücre boyama tampon 1:200 seyreltilmiş. 10 dakika buz üzerinde inkübe edin. Hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
Antikor kokteyl mix ve inkübe 30 dakika buz üzerinde 50 ul ekleyin. Her antikor ilk en iyi seyreltme değerlendirmek için titre edilmelidir. , Lazer ve belirli bir akış sitometresi filtre ayarları yeteneklerine göre seçilen uygun florokrom kombinasyonları kullanın.
Hücre boyama tampon 100-200 ul hücreleri hücre boyama tampon, tekrar süspansiyon pelet yıkayın ve sitometresinin hemen analiz, ya da alternatif PBS içinde hazırlanan% 2 paraformaldehid (PFA) yeniden süspanse hücreleri, 4 ve üzerinde gece saklanan olabilir ° C .
Temsilcisi Sonuçlar:
Gradyanlar iplik sonra, 70% -30% interfaz tanımlanmış bir beyaz hale olmalıdır ve naif bir fare kurtarıldı hücrelerin kantitatif başına 3-5 x10 5 fare hücreleri (beyin + omurilik) boyun eğmek zorundadır. Iltihaplı beyin inflamatuar hücrelerin MSS hakaret ya da hastalık modeli (Şekil 1) göre sayıları değişen olabilir.
Şekil 1 pik hastalığı Naive ve EAE-beyin hücreleri, mononükleer izolasyonu. Beyin hücreleri süspansiyonlar süreksiz% 70 /% 30 Percoll gradyanlar içinde ayrıldı. Hücreler boyanmış, buz üzerinde 30 dakika boyunca anti-CD45 antikorları takip Fc blok ile inkübe edildi. Hücreler hücre boyama tampon durulanır, ve bir LSR-II% 2 PFA önceden satın alma sabit. Üç farklı popülasyonlar görüntülenmiştir Y-ekseni, CD45 yoğunluğu ölçülür. CD45 hi infiltre hücrelerin bağışıklık fenotipi ileri karakterizasyonu ek antikorlar kullanılarak uygulanır ve daha sonra flow sitometri ile analiz edilir.