Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Kilitli Nükleik Asit modifiye Oligonükleotidler Transfeksiyon ve Sivrisinek Hücreler Hedef Genler Mutagenez

9.9K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/2355

⸱

26 Aralık 2010

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Microbiology and Immunology, University of California, Davis, 2Département Génétique et Développement, Institut Cochin, Université Paris Descartes

Bu makalede

Özet

Hem de özel transfekte hedef genlerin tek bir nükleotid yerine Oligonükleotidler sitesi için kullanılabilir Anofel gambiae Ve Anofel stephensi Hücreler.

Özet

Sıtma parazitinin, sıtma etkeni, her yıl 250 milyon yeni enfeksiyon sonucu enfekte Anofel sivrisinek sokması ile bulaşır. Onlarca yıllık araştırma rağmen, sıtmaya karşı bir aşı roman kontrol stratejileri için gereğinin altını, hala orada. Bir yenilikçi bir yaklaşım etkili sıtma paraziti iletimini kontrol etmek için genetiği değiştirilmiş sivrisineklerin kullanılmasıdır. Parazit geliştirme 1 düzenlemek için kasıtlı olarak değişiklikler, hedef mutagenez üzerinden sivrisinek hücre sinyal yolları bulundu. Bu çalışmalarda, biz, dönüşüm için potansiyel gen hedefler belirlemeye başlayabilirsiniz. Hedeflenen mutagenez, geleneksel bir hedef gen ve büyük bir DNA molekülü arasındaki homolog rekombinasyon güvenerek vardır. Ancak, stabil bir şekilde dönüştürülmüş hücre hatları üretimi için bu tür karmaşık DNA molekülleri inşası ve kullanımı, pahalı, zaman alıcı ve genellikle verimsiz. Bu nedenle, kilitli nükleik asit modifiye oligonükleotidler (LNA-ons) kullanarak bir strateji episomal ve kromozomal DNA gen hedefleri (2) içine yapay tek nükleotid değiştirmelerin tanıtmak için yararlı bir alternatif sağlar. LNA-ON-aracılı hedef mutagenez, maya ve fareler 3,4 hem de kültür hücreleri ilgi genler nokta mutasyonları tanıtmak için kullanılır olmuştur . LNA-ons Anofel gambiae ve Anofel stephensi hücreleri hem de yeşil floresan protein (GFP) ifade mavi floresan protein (BFP) ifadesi bir anahtarı sonuçları transfekte episomal hedef tek bir nükleotid değişimi tanıtmak için kullanılabileceğini gösteriyor . Bu dönüşüm, sivrisinek hücreleri hedef genlerin etkili mutagenez LNA-ons aracılık ve bu tekniği, in vitro ve in vivo kromozomal hedefleri mutagenez için geçerli olabileceğini düşündürmektedir ki ilk kez gösteriyor.

Protokol

  1. Protokol başlamadan önce, bu deneyde kullanılan sivrisinek hücreleri sağlıklı ve ~% 80 birleştiği noktada yer yapışık eğer (Şekil 1) olduğunu belirlemek önemlidir. Büyümüş ya da sağlıksız hücreleri düşük transfeksiyon verimlilik ve tutarsız sonuçlar verecektir.
  2. 30 dakika boyunca 28 ° C su banyosunda kullanmak için önce tüm medya Isınma.
    1. MEM, Earle w / glutamin,% 5 ısı inaktive FCS,% 0.2 D-glukoz,% 1 penisilin-streptomisin antibiyotik ve% 1 non-esansiyel amino asitleri: A. stephensi MSQ43 hücreleri E5 orta gerektirir .
    2. A. gambiae SUA5B hücreleri S2 ortama ihtiyaç Schneider Drosophila, orta,% 5 ısı inaktive FCS, ve% 1 penisilin-streptomisin antibiyotik :
  3. Tüm transfeksiyon reaktif malzemeler, plazmid ve oligonükleotidler çözülme ve buz üzerinde saklayın.
  4. Tüm işlemler, steril tekniği kullanarak bir doku kültürü kaputu yapılmalıdır.
  5. Yapışık hücrelere (A. gambiae SUA5B, A. stephensi MSQ43) hücreleri bozmadan eski medya aspire için, 28 kaynaştı taze medya eşdeğer bir hacim ekleme ° C ve daha sonra alt hücreleri durulayın bir pipet kullanarak şişesi.
  6. Hücre konsantrasyonu belirlenir ve 1x10 6 hücre / mL son konsantrasyon için ayarlanabilir olmalıdır. Transfeksiyon reaktif malzemeleri hazırlarken Hücreler oda sıcaklığında muhafaza edilebilir.
  7. 6 plaka her iyi sivrisinek hücreleri (1x10 6 hücre / ml) 1 ml ekleyin. Her deneysel koşul için (aşağıya bakın) bir tabak ayarlayın.
    Tablo I, genel bir transfeksiyon için pipetleme şeması. Tablo II BFP özel LNA-ons kullanarak tek bir nükleotid başarılı mutagenez test etmek için beş temel şartından özetliyor. Ilk iki pGFP ve pBFP, sırasıyla pozitif ve negatif kontroller. Kalan BFP özel LNA-ons artan konsantrasyonları ile pBFPs deneysel koşullar. 8 - 12 üzerinden adımları buna göre, her durum için uygun miktarda reaktif ekleyin.
  8. 1,5 mL steril bir mikrosantrifüj tüp plazmid DNA transferi ve AT tampon uygun hacim ekleme.
    1. 1 mcL plazmid DNA (1 mcg / ml), 99 EC tampon mcL ekleyin.
    2. 1 mcL pGFP (mcL / 1μg) için, 99 EC tampon mcL ekleyin.
    3. 1 mcL pBFP (mcL / 1μg) için, 99 EC tampon mcL ekleyin.
    4. 1 mcL pBFP (mcL / 1μg) ve 1 mcL ON (mcg / ml), 98 EC tampon mcL ekleyin.
    5. 1 mcL pBFP (mcL / 1μg) ve ON 5 mcL (mcL / 1μg) için, 94 EC tampon mcL ekleyin.
    6. 1 mcL pBFP (mcL / 1μg) ve ON 10 mcL (mcL / 1μg) için, 89 EC tampon mcL ekleyin.
  9. Sonra yavaş yavaş 1 mcg başına kullanılan DNA Enhancer ekleyin.
    1. 1 mcL plazmid DNA için, 8 mcL Enhancer ekleyin.
    2. 1 mcL pGFP için, 8 mcL Enhancer ekleyin.
    3. 1 mcL pBFP için, 8 mcL Enhancer ekleyin.
    4. 1 ON mcL pBFP ve 1 mcL için, 16 mcL Enhancer ekleyin.
    5. 1 ON mcL pBFP ve 5 mcL için, 48 mcL Enhancer ekleyin.
    6. 1 ON mcL pBFP ve 10 mcL için, 88 mcL Enhancer ekleyin.
  10. 1 sn ve çözüm tüpün alt kısmında emin olun Vortex DNA / tampon / Enhancer karışımı. Sonra 5 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
  11. 10 saniye boyunca 1 mg plazmid DNA ve vorteks başına Effectene reaktif ekleyin. Çözüm 10 dakika oda sıcaklığında inkübe sonra tüpün dibinde olduğunu ve onaylayın.
    1. 1 mcL plazmid DNA için 10 mcL Effectene (Tablo I) ekleyebilirsiniz.
    2. 1 mcL pGFP için, 10 mcL Effectene (Tablo II) ekleyin.
    3. 1 mcL pBFP için, 10 mcL Effectene (Tablo II) ekleyin.
    4. 1 ON mcL pBFP ve 1 mcL için, 20 mcL Effectene (Tablo II) ekleyin.
    5. 1 ON mcL pBFP ve 5 mcL için, 60 mcL Effectene (Tablo II) ekleyin.
    6. 1 ON mcL pBFP ve 10 mcL için, 110 mcL Effectene (Tablo II) ekleyin.
  12. Isıtılmış medya DNA / tampon / Enhancer / Effectene karışıma damla damla eklenerek son hacim 1000 mcL her tüp getirin. Medya çok çabuk eklenir DNA olabilir, bu noktada hızlandırabilir. 3-4 kez yukarı aşağı pipetleme hafifçe karıştırın.
    1. 1 mcL plazmid DNA için, 882 mcL medya (Tablo I) ekleyebilirsiniz.
    2. 1 mcL pGFP için, 882 mcL medya (Tablo II) ekleyin.
    3. 1 mcL pBFP için, 882 mcL medya (Tablo II) ekleyin.
    4. 1 ON mcL pBFP ve 1 mcL için, 864 mcL medya (Tablo II) ekleyin.
    5. 1 ON mcL pBFP ve 5 mcL için, 792 mcL medya (Tablo II).
    6. 1 ON mcL pBFP ve 10 mcL için, 702 mcL medya (Tablo II) ekleyin.
  13. Sonra yavaş yavaş her bir seferde bir damla 1 ml uygun DNA / Enhancer / Effectene karışımı ekleyin.
  14. Swirl plaka nazikçe hücreleri ve transfeksiyon karışımı eşit dağılımını sağlamak için. Incubathücrelerin normal büyüme koşulları altında e.
  15. Bir gün Transfeksiyonu sonra, yavaşça medya dışarı aspirat ve yavaş yavaş taze ısındı ortam eşdeğer bir hacmi ile değiştirin. Bunu yaparken kuyuların dibinde hücre tabakalarından rahatsız değil önemlidir.
  16. İki gün sonra transfeksiyon transfeksiyon verimlilik (Şekil 2) belirlemek için floresan mikroskop altında pGFP transfekte pozitif kontrol hücreleri inceler.
  17. SUA5B hücreler çok hızlı büyür ve büyümüş olacak. Dört gün sonra eski ortam aspire ve taze ısındı ortam yavaş yavaş eşdeğer bir hacim ekleme transfeksiyon ince bu hücrelerin.
  18. Kuyuları için yeni medya ekledikten sonra, her bir kuyunun dibinden yukarı pipeting tüm hücreleri ayırmak ve aşağı, hücre karışımından yarım hacmi (1 ml) atın ve 2 için son hacmi getirmek için 1 ml taze ısındı medya eklemek ml.
  19. Gerektiği gibi ince, sağlıklı ve büyümüş değil emin olun günlük hücreleri kontrol edin.
  20. Hücrelerin analiz için bunları toplamak için normal şartlar altında 5-7 gün transfeksiyon önce büyümek için izin verin.
  21. 5-7 gün transfeksiyon, tüm kuyularda eski medya aspire ve her bir kuyu için 1 mL steril oda sıcaklığında PBS ekleyerek hücreleri toplamak.
  22. Kuyunun dibinden yukarı ve aşağı pipetleme tarafından hücreleri ayırın ve hücre karışımı 5 ml ani kap tüpleri transferi ve hemen hücreler flow sitometri ile analiz.

Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 1
Şekil 1 Untransfected sağlıklı A. stephensi MSQ43 (A) ve A. yaklaşık% 80 izdiham gambiae SUA5B (B) hücreleri.

Şekil 2
Şekil 2 A. stephensi MSQ43 (A) ve A. gambiae SUA5B (B) hücrelerin pozitif kontrol GFP ile plazmid ifade transfekte.

Şekil 3
Şekil 3 Flow sitometri BFP-özel kilitli nükleik asit modifiye oligonükleotidler (LNA-ons) ile tek nükleotid aşağıdaki transfeksiyon mutagenez BFP dönüşüm yoluyla GFP doğrulayan veriler. SUA5B hücreler, negatif kontrol olarak (pBFP) plazmid ifade eden bir BFP ile, pozitif kontrol olarak plazmid ifade GFP (pGFP) ile transfekte, ya da pBFP ve BFP özel LNA-ons artan konsantrasyonlarda. (A), soldan sağa doğru gösteren akış sitometri veri Ayırıcı stratejisi:, canlı hücreleri, propidium iyodür (PI) negatif hücreler ve transfeksiyon aşağıdaki GFP pozitif hücrelerin beş gün ileri karşı tarafında dağılım. (B) (A) LNA-ons pBFP ve artan konsantrasyonlarda aşağıdaki transfeksiyon GFP pozitif hücrelerin yüzdesi Grafik gösterilmiştir.

Tablo 1
Tablo I. Transfeksiyon.

Tablo 2
Tablo II. Şekil 1'de kullanılan Transfeksiyon.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada A. LNA-ons transfeksiyon aşağıdaki episomal bir gen hedef tek bir nükleotid hedeflenen dönüşüm için in vitro metod ve kanıtların bir mevcut stephensi ve A. gambiae hücreleri. LNA-ON-aracılı gen dönüşümü bir site-spesifik DNA onarım yanıt indüksiyon gerektirir; bizim veri sivrisinek hücreleri için bu siteye özgü mutagenez mekanizması destek olduğunu göstermektedir. Burada sunulan yöntem episomal bir hedef dönüşüm dayalı iken, bizim veri, diğer sistemlerde olduğu gibi LNA-ON-arac...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

Biz sitometrisi ile ona yardım için California Ulusal primat Araştırma Merkezi Abbie Spinner teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü (NIAID) Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) AI073745, AI080799 ve AI078183 fon tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Effectene transfeksiyon reaktifiQiagen301425
GFP kontrol plazmidi (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg)InvitrogenK4935-00
BFP plazmidi (pcDNA5/FRT/TO)Dr. Concordet'ten hediye3
LNA-ON'larDr. Concordet'ten hediye3
MEM, glutaminli Earle’sInvitrogen11095
Fetal calf serum (FCS)Invitrogen16000
Schneider’s Drosophila besiyeriInvitrogen11730
Esansiyel olmayan amino asitlerInvitrogen11140
%10 D-glukozSigma-AldrichG5767
Penisilin-streptomisin antibiyotiğiInvitrogen15140
6 kuyucuklu kültür plakalarıCorning3516

Kaynaklar

  1. Corby-Harris, V. D. A., Watkins de Jong, L., Pakpour, N., Antonova, Y., Ziegler, R., Ramberg, F., Lewis, E. E., Brown, J. M., Luckhart, S. L., Riehle, M. A. A novel strategy for controlling malaria transmission in the mosquito Anopheles stephensi. PLOS Pathogens. , Forthcoming (2010).
  2. Braasch, D. A., Corey, D. R. Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA. Chem Biol. 8, 1-7 (2001).
  3. Andrieu-Soler, C. Stable transmission of targeted gene modification using single-stranded oligonucleotides with flanking LNAs. Nucleic Acids Res. 33, 3733-3742 (2005).
  4. Parekh-Olmedo, H., Drury, M., Kmiec, E. B. Targeted nucleotide exchange in Saccharomyces cerevisiae directed by short oligonucleotides containing locked nucleic acids. Chem Biol. 9, 1073-1084 (2002).
  5. Rhee, W. J., Santangelo, P. J., Jo, H., Bao, G. Target accessibility and signal specificity in live-cell detection of BMP-4 mRNA using molecular beacons. Nucleic Acids Res. 36, e30-e30 (2008).
  6. Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. Genotyping SNPs with molecular beacons. Methods Mol Biol. 212, 111-128 (2003).
  7. Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat Biotechnol. 16, 49-53 (1998).
  8. Blandin, S. A. Dissecting the genetic basis of resistance to malaria parasites in Anopheles gambiae. Science. 326, 147-150 (2009).
  9. Niare, O. Genetic loci affecting resistance to human malaria parasites in a West African mosquito vector population. Science. 298, 213-216 (2002).
  10. Riehle, M. M. Natural malaria infection in Anopheles gambiae is regulated by a single genomic control region. Science. 312, 577-579 (2006).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Kilitli Nükleik Asit OligonükleotitleriBölgeye Özgü MutajenezSivrisinek Hücresi TransfeksiyonuFloresan Protein EkspresyonuAkış Sitometrisi AnaliziEpisomal Gen HedeflemeAnopheles gambiae HücreleriBFP'den GFP'ye DönüşümTransfeksiyon Reajanı HazırlamaHücre Yoğunluğu İzleme
Kilitli Nükleik Asit modifiye Oligonükleotidler Transfeksiyon ve Sivrisinek Hücreler Hedef Genler Mutagenez
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.