Hem de özel transfekte hedef genlerin tek bir nükleotid yerine Oligonükleotidler sitesi için kullanılabilir Anofel gambiae Ve Anofel stephensi Hücreler.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Kilitli Nükleik Asit modifiye Oligonükleotidler Transfeksiyon ve Sivrisinek Hücreler Hedef Genler Mutagenez
Bu makalede
Özet
Özet
Sıtma parazitinin, sıtma etkeni, her yıl 250 milyon yeni enfeksiyon sonucu enfekte Anofel sivrisinek sokması ile bulaşır. Onlarca yıllık araştırma rağmen, sıtmaya karşı bir aşı roman kontrol stratejileri için gereğinin altını, hala orada. Bir yenilikçi bir yaklaşım etkili sıtma paraziti iletimini kontrol etmek için genetiği değiştirilmiş sivrisineklerin kullanılmasıdır. Parazit geliştirme 1 düzenlemek için kasıtlı olarak değişiklikler, hedef mutagenez üzerinden sivrisinek hücre sinyal yolları bulundu. Bu çalışmalarda, biz, dönüşüm için potansiyel gen hedefler belirlemeye başlayabilirsiniz. Hedeflenen mutagenez, geleneksel bir hedef gen ve büyük bir DNA molekülü arasındaki homolog rekombinasyon güvenerek vardır. Ancak, stabil bir şekilde dönüştürülmüş hücre hatları üretimi için bu tür karmaşık DNA molekülleri inşası ve kullanımı, pahalı, zaman alıcı ve genellikle verimsiz. Bu nedenle, kilitli nükleik asit modifiye oligonükleotidler (LNA-ons) kullanarak bir strateji episomal ve kromozomal DNA gen hedefleri (2) içine yapay tek nükleotid değiştirmelerin tanıtmak için yararlı bir alternatif sağlar. LNA-ON-aracılı hedef mutagenez, maya ve fareler 3,4 hem de kültür hücreleri ilgi genler nokta mutasyonları tanıtmak için kullanılır olmuştur . LNA-ons Anofel gambiae ve Anofel stephensi hücreleri hem de yeşil floresan protein (GFP) ifade mavi floresan protein (BFP) ifadesi bir anahtarı sonuçları transfekte episomal hedef tek bir nükleotid değişimi tanıtmak için kullanılabileceğini gösteriyor . Bu dönüşüm, sivrisinek hücreleri hedef genlerin etkili mutagenez LNA-ons aracılık ve bu tekniği, in vitro ve in vivo kromozomal hedefleri mutagenez için geçerli olabileceğini düşündürmektedir ki ilk kez gösteriyor.
Protokol
- Protokol başlamadan önce, bu deneyde kullanılan sivrisinek hücreleri sağlıklı ve ~% 80 birleştiği noktada yer yapışık eğer (Şekil 1) olduğunu belirlemek önemlidir. Büyümüş ya da sağlıksız hücreleri düşük transfeksiyon verimlilik ve tutarsız sonuçlar verecektir.
- 30 dakika boyunca 28 ° C su banyosunda kullanmak için önce tüm medya Isınma.
- MEM, Earle w / glutamin,% 5 ısı inaktive FCS,% 0.2 D-glukoz,% 1 penisilin-streptomisin antibiyotik ve% 1 non-esansiyel amino asitleri: A. stephensi MSQ43 hücreleri E5 orta gerektirir .
- A. gambiae SUA5B hücreleri S2 ortama ihtiyaç Schneider Drosophila, orta,% 5 ısı inaktive FCS, ve....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada A. LNA-ons transfeksiyon aşağıdaki episomal bir gen hedef tek bir nükleotid hedeflenen dönüşüm için in vitro metod ve kanıtların bir mevcut stephensi ve A. gambiae hücreleri. LNA-ON-aracılı gen dönüşümü bir site-spesifik DNA onarım yanıt indüksiyon gerektirir; bizim veri sivrisinek hücreleri için bu siteye özgü mutagenez mekanizması destek olduğunu göstermektedir. Burada sunulan yöntem episomal bir hedef dönüşüm dayalı iken, bizim veri, diğer sistemlerde olduğu gibi LNA-ON-arac.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Biz sitometrisi ile ona yardım için California Ulusal primat Araştırma Merkezi Abbie Spinner teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü (NIAID) Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) AI073745, AI080799 ve AI078183 fon tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Effectene transfeksiyon reaktifi | Qiagen | 301425 | |
| GFP kontrol plazmidi (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg) | Invitrogen | K4935-00 | |
| BFP plazmidi (pcDNA5/FRT/TO) | Dr. Concordet'ten hediye3 | ||
| LNA-ON'lar | Dr. Concordet'ten hediye3 | ||
| MEM, glutaminli Earle’s | Invitrogen | 11095 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Invitrogen | 16000 | |
| Schneider’s Drosophila besiyeri | Invitrogen | 11730 | |
| Esansiyel olmayan amino asitler | Invitrogen | 11140 | |
| %10 D-glukoz | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Penisilin-streptomisin antibiyotiği | Invitrogen | 15140 | |
| 6 kuyucuklu kültür plakaları | Corning | 3516 |
Kaynaklar
- Corby-Harris, V. D. A., Watkins de Jong, L., Pakpour, N., Antonova, Y., Ziegler, R., Ramberg, F., Lewis, E. E., Brown, J. M., Luckhart, S. L., Riehle, M. A. A novel strategy for controlling malaria transmission in the mosquito Anopheles stephensi. PLOS Pathogens. , Forthcoming (2010).
- Braasch, D. A., Corey, D. R.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
