Yöntem makalesi

Genetik Etiketli Retina Ganglion Hücreleri Işık Tepkisi Record İzole Retina Hazırlık

DOI:

10.3791/2367

⸱

26 Ocak 2011

 , 
1Department of Neuroscience, University of Minnesota

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, fare izole retinal hazırlanması incelemek ve kaydetmek için nasıl bir açıklama sağlar. Özellikle, floresan etiketli ganglion hücre popülasyonu ışık yanıtlarını kaydetmek ve daha sonra belirlemek ve morfolojisi analiz nasıl açıklar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Işık retina 1 çubuk ve koni fotoreseptörlerin uyarır, omurgalı vizyonu ilk adımları yer almaktadır. Bu bilgiler daha sonra ON ve OFF yollar olarak bilinen ayrılmış;. Bipolar hücreler, ışık şiddeti artar (BCS Açık) veya azalır (BCS Kapalı) yanıt olarak depolarize fotoreseptörlerin sinyal ışık bilgi (BCS). Işık bilgi bu ayrımı Kapalı BCS doğrudan eksitatör giriş alırsınız iç pleksiform katman (IPL), ya da Kapalı sublamina tabakalandırılması dendritler retina ganglion hücrelerinin (RGCs) seviyesinde tutulur, ya da içinde tabakalandırılması BCS Açık doğrudan eksitatör giriş alırsınız IPL Açık sublamina. Aydınlatma (Açık ve Kapalı yollar) olarak artar veya azalır ile ilgili bilgiler bu ayrımı paralel olarak korunmuş ve beyne sinyal.

RGCs retinanın çıkış hücreleri, ve böylece ışık bilgileri beynin görme çekirdekleri sinyal nasıl anlamak için çalışma önemli bir hücre. Son on yılda fare genetik gelişmeler, özel RGC nüfus elektrofizyolojik kayıt için hedef RGC alt tipleri 2 3 4 ve özel kimlik izin vermek için floresan protein etiketli floresan muhabiri fare hatları çeşitli sonuçlandı . Burada, sağlam bir, izole retinal hazırlanmasında floresan etiketli ganglion hücrelerinin ışık yanıtları kaydetmek için bir yöntem mevcut. Bu izole retinal dendritik mili sağlam ve tüm RGC dendritik mili boyunca girişler korunur RGCs kayıtları için hazırlık sağlar. Bu yöntem, ganglion hücre alt tiplerinin çeşitli çapında geçerli ve tek hücreli fizyolojik teknikler geniş bir yelpazede uygun.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan Kullanım Bildirimi: Hayvanlar, Minnesota Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu Üniversitesi tarafından onaylanan protokolleri kullanarak, Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu açıklanan kurallarına uygun olarak bakıldı .

1) Hazırlık çözümler

  1. Elektrofizyolojik kayıt yapmadan önce, hücre içi, ekstrasellüler ve enzim çözümleri hazırlıklı olması gerekiyor.
  2. Ekstrasellüler çözüm: 1 litre ve 1.9 g sodyum bikarbonat (23 mM) ile H 2 O toz Ames 'orta karışımı bir şişe (8.8g) (Sigma). Bütün noktalarında ekstrasellüler çözüm% 95 O 2 /% 5 CO 2 gaz karışımı ile doymuş yağlardır. 200 ml, retina depolama için bir behere aktarın. Yerçekimi perfüzyon için perfüzyon sistem konteyner retina monte sonra kalan çözüm yerleştirin.
  3. Hücre içi çözüm: Hücre içi bir çözüm daha önce yapılan ve daha sonra aliquoted 500-1000 mcL alikotları ve -20 ° C'de saklanan olmalıdır Hücre içi bir çözüm biz Burada gösterilen akım pensi kayıtları (mM) için gerekli olan deney bağlı olarak değişir: 125 K-glukonat, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 EGTA, 10 Hepes, 2 Na 2-ATP, 0.5 mM NaGTP KOH 5 ile 7.2 pH. 10 mcM Alexafluor-594 hydrazide (Invitrogen) gibi bir floresan tracer deney ve neurobiotin (% 0.3) sırasında dendritler görselleştirmek eklenebilir kayıt aşağıdaki hücre anatomisi analizi için dahil edilebilir. Kaydetmek için hazır olduğunuzda, hücre içi çözüm Çözülme.
  4. Enzim çözüm: 10000 Birimleri kollajenaz (Worthington Kimyasallar) ekstrasellüler çözüm 4.150 ml içine 83 mg Hyaluronidase (Worthington Kimyasallar) ile birleştirin. -20 ° C'de 50 mcL alikotları saklayın Alikot birkaç hafta için kullanılabilir. Retina tedavi etmek için hazır olduğunuzda, kabarmış ekstrasellüler çözüm 500 mcL kısım seyreltilmiş.
  5. Fosfat Çözümü (PBS) Tamponlu: 800 mL H 2 O 8 g NaCl, KCl, 0.2 g Na 2 HPO 4, 1.4 g ve 0.24 g KH 2 PO 4 ekleyin. NaOH ile pH 7.4 'e getirin. 1 L. ses seviyesini ayarlayın
  6. 0.2 M Fosfat Tampon: 800 ml H 2 O, Na 2 HPO 4 21.8 g ve 6.4 g NaH 2 PO 4 ekleyin. 1 L. hacim getir
  7. % 4 Paraformaldehit Çözüm: Isı 60 ila 50 ml H 2 O ° C 4g paraformaldehid ekleyin ve birkaç dakika daha çırpın. 1M NaOH birkaç damla (yaklaşık 5 damla), çözüm açıktır kadar karıştırmaya devam edin. Behere 50 ml 0.2 M fosfat tamponu ekleyin. PH şeritleri (~ 7.4) ile pH kontrol edin. Filtre ve serin.
  8. Engelleme solüsyonu (% 10 keçi serumu,% 0.5 'TritonX100): keçi serum ve 10 mcL Triton X-100 0.2 ml 1.8 ml PBS ekleyin. TritonX-100 doku permeabilise hizmet vermektedir.
  9. Streptavidin solüsyonu (% 5 keçi serumu,% 0.5 'TritonX100, 1:500 Streptavidin 594): 1.9 ml PBS keçi serum 0.1 ml, 10 mcL Triton X-100 ve 4 Streptavidin 594 mcL ekleyin.

2) İzolasyon fare retinanın

Gerekli Diseksiyon araçları: 1 # 2 Forseps, 2 # 5 Forseps, oftalmolojik makas

  1. Bu durumda, onaylanmış protokollere göre fare Euthanize CO 2 boğulma ve aydınlatmak göz küresi, göz arkasında bir kesik # 2 forseps yavaşça ekleme ve göz küresi dışarı kaldırma .
  2. Göz küresi ekstrasellüler çözümü ile 35 mm Petri kabı içine yerleştirin. Optik sinir ve oftalmolojik makas kullanarak herhangi bir bağlı ekstraoküler kasların veya bağ dokusu kesin. Oftalmolojik bir makas ile kesip kornea ve lens # 5 forseps kullanarak çekin. # 5 forseps bir çift kullanarak sklerasına Gözyaşı ve, retina ve sklera optik disk buluşmak optik sinir koparmak için forseps kullanabilir. Göz yuvası uzak retinanın hafifçe kabuğu. İpucu: süresini en aza indirmek için bir sonraki adıma geçmeden önce, hem de retina her adım yapın.
  3. Forseps retinaya bağlı vitreus kaldırmak için kullanın. Bu forseps ile retina üzerinde şeffaf vitreus "kapma" yapılabilir. Vitreus, eğer başarıyla kaldırıldı, forseps açık bir, jelatinimsi bir madde olarak görünür olmalıdır. İpucu: vitreus yarım aşağıdaki kaldırma retina Dilimleme kullanılabilir doku miktarı en üst düzeye çıkarmak ve daha kolay odasının montajı yapacak.
  4. Sindirilmiş olmak için hazır olana kadar minimum ortam ışığı ile karanlık bir ortamda oda sıcaklığında oksijenli ekstrasellüler çözüm retina tutun. Retinanın ~ 6 saat boyunca bu şekilde saklanabilir.

3) retinanın enzim karışımı ile kayıt odasında Tedavi ve montaj

  1. 35 mm Petri kabındaki 500 mcL ekstrasellüler çözüm, yerinde çözüm kollajenaz / hiyalüronidaz bir kısım seyreltilir ve retina transferi.
  2. Retina içeren tutunyavaşça sallanarak 15 dakika için% 95 O2 /% 5 CO 2 ortamında ing Petri kabı, kapalı ve karanlık. Bu adım, kalan vitreus sindirerek yardımcıları ve ganglion hücre tabakası kolay erişim sağlar. İpucu: daha az vitreus veya olumsuz etkileri gözlenmiştir genç hayvanlardan elde edilen retina, süresi ~ 5 dakika kısaltılabilir.
  3. Enzim içeren orta retina çıkarın ve ekstrasellüler çözümü iyice yıkayın.
  4. Retinanın fotoreseptör tabakası ile aşağı bakacak şekilde kamara 6 kayıt içine aktarın. Bir pipet veya doku ya da sıvı kalan uzak Wick ve retina ganglion hücre tabakası ile özellikle temastan kaçınarak sadece kenarları, dokunmaya doku düzleştirmek için retinanın kenarlarında dışarı rulo. Doku çapa ve ekstrasellüler çözüm odasının hemen doldurmak için retina üzerinde naylon örgü ile platin yüzük yerleştirin.
  5. Mikroskop sahneye Mount kayıt odası, yerçekimi perfüzyon ve vakum emiş tüpü takmak ve topraklama kablosu takın.

4) EGFP ifade ganglion hücrelerinin Yerelleştirme ve hafif stimülasyon

  1. 1 ml / dakika ya da daha hızlı bir fiyatla ekstrasellüler çözümü ile yerçekimi retina serpmek. İpucu: perfüzyon hızı çok yavaş ise, doku yeterince oksijenli ve sinaptik sinyal bozulabilir olmayacaktır.
  2. Hücre içi solüsyonu ile doldurun ve bir kayıt pipet pipet tutucu takın. İpucu: 3 5MΩ aralığında dirençleri ile Pipetler iyi sonuçlar verebilir.
  3. Kayıt pipet yerelleştirilmesine düşük büyütme (10X amacı, NA 0.3) kızılötesi diferansiyel girişim kontrast (DIC) optik altında retina gözünüzde canlandırın. Kızılötesi ışık, görünür ışığın retinada maruziyeti en aza indirmek ve ışık adaptasyon en aza indirmek için kullanılır. Yüksek büyütme (40X amacı, NA 0.8) taşı ve doku yukarıda sadece görünümü içine elektrod getirmek.
  4. Yüksek büyütme (40X objektif), Epifloresans (EGFP için 480 nm) ile retina aydınlatmak ve bant (Şekil 1A) kullanarak bilgisayar monitörü floresan bir ganglion hücre ve işareti seçin.
  5. DIC ve kızılötesi aydınlatma altında, kayıt elektrodu hedeflenen ganglion hücresi (Şekil 1A) yakın pozisyon. Temizlik alanında hemen kayıt elektrot, polietilen boru ile pipet sahibine bağlı bir 12cc plastik enjektör ile hafif pozitif basınç uygulayarak hücre kapsayan. Amplifikatör, herhangi bir gerilim uzaklıklar sıfır. Yeri elektrot seçilen ganglion hücre üzerine gamze hücre yüzeyinde görünene kadar.
  6. Gerilim kelepçe modunda amplifikatör, bir test darbe uygulamak ve pipet akımını geçirerek izlemek. Elektrot ve hücre arasındaki mühür oluşturmak için negatif basınç uygulayın. Negatif basınç, hücre, hücre zarı ve pipet arasındaki GΩ elektrik mühür akım göstergesidir tutarak kadar mühür ve bekleyin başladığında bırakın. Kapasitif transientler görünür ve daha sonra basınç herhangi bir uygulama bırakana kadar nazik bakliyat negatif basınç uygulayın. İpucu: erişim (seri) direnci yüksek ise (> 30MΩ), bu genellikle, negatif basınç ek, çok nazik, bakliyat tarafından ıslah edilebilir.
  7. Bir istikrarlı bir mühür, bir darbe negatif basınç uygulamak ulaşıldı. Tüm hücre modu elde edildikten sonra, hücre karanlık 5 dakika boyunca uyum sağlar. Kayıt, tam alan, beyaz ışık stimülasyonu (Şekil 1B) akım pensi modu, tepki.
  8. Kayıt sonrasında Alexafluor-594 dendritler yayılmış olacaktır. 594 nm Epifloresans altında tracer görüntülenebilmekte ve ganglion hücre olup olmadığını On-Epifloresans ve DIC kızılötesi optik 5 arasında geçiş Off-ya da Bi-tabakalı belirlemek için kullanılır.
  9. Pipet ve retina immünohistokimya için işlenmiş olacak neurobiotin dahil ise, o zaman pipetle yavaşça zarının en az kesilme sağlamak için retrakte olmalıdır.

5) Analiz kaydedilen ganglion hücrelerinin anatomisi

Neurobiotin ile doldurma kayıt sonrasında ganglion hücrelerinin daha ayrıntılı morfolojik analiz sağlar. İpucu: kaydedilmiş bir ganglion hücre ve detaylı morfolojisi arasındaki özel ilişki isteniyorsa, bu hazırlık için sadece RGC bir kayıt ve doldurmak için en iyisi olabilir.

  1. Neurobiotin hücre içi bir çözüm dahil edildi, sonra paraformaldehid çözüm retina yerleştirmek ve 4 gece düzeltmek ° C
  2. PBS içinde, en az 6 değişiklikler en az 2 saat durulayın. Engelleme çözümü içeren bir tabak retina aktarın. Shaker, 2 saat boyunca oda sıcaklığında çözümü engelleme bekletin.
  3. Streptavidin çözümü ile engelleme çözüm değiştirin. 2 gün, 4 ° C çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. PBS içinde retina, 6 çalkalama, her biri 20 dakika durulayın.
  4. Bir bardak slayt Vectashield retina monte edin.Retina ganglion hücrelerinin yerleştirilmesi gerekir. Konfokal mikroskobu (Şekil 1C) gerçekleştirin.

Temsilcisi Sonuçlar

Retinanın sağlıklı ve diseksiyon başarılı olursa, bireysel ganglion hücrelerinin yüksek büyütme (Şekil 1A) DIC altında görünür olmalıdır. Sağlıksız retina büyük, toz çekirdekleri ve atılmalıdır. Belirli bir ganglion hücre sinaptik yanıt sağlam ise, o hücrenin bir içsel ışığa ganglion hücresi (Şekil 1B), sürekli bir depolarizasyon durumunda, ışık başlangıcında yanıt vermek ya da aksiyon potansiyelleri ile ofset ve olmalıdır.

figure-protocol-1
Şekil 1. Yerelleştirme, kayıt, ve bir floresan etiketli retina ganglion hücre boyama (A) GFP pozitif RGC 40X büyütme (sol panel) ve DIC aydınlatma (sağ panel) altında epifluorescent aydınlatma altında görüntülendi. (B) floresan etiketli RGC tüm hücre akım kelepçe modunda kaydedilen M2 özünde ışığa duyarlı retina ganglion hücre Synaptic ışık yanıt. (C) tüm hücre kayıt için hedeflenen Epifloresans altında tespit edilmiştir M1 özünde ışığa duyarlı retina ganglion hücre, neurobiotin dolu ve ardından immünohistokimya için işlenmiş.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu teknik, izole bir retina herhangi bir retina ganglion hücre kayıtları geçerlidir. Yukarıda kullanılan fare doğrultusunda rağmen özünde ışığa, melanopsin ifade RGCs EGFP 2, 5 ile etiketlenir, bu protokol floresan ile işaretlenmiş diğer RGC hatları kolayca devredilemez veya yanı sıra rastgele seçilen RGCs kayıt jeneralize olabilir. Bu teknik, her RGC ve ilgili giriş nöronların dendritik mili tamamen değişmeden kalır, çünkü özellikle değerlidir. Kayıtları, akım veya gerilim kelepçe modları, yapılandırma hücre...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma NIH R01EY012949, R21EY018885, T32 EY0707133 hibe kısmen desteklenmiştir. Darwin'in asın Biz onun teknik yardım için teşekkür ederim.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Ames’ BesiyeriSigma-AldrichA1420
KollagenazWorthington BiochemicalLS005273
HiyaluronidazWorthington BiochemicalLS002592
Sodyum BikarbonatSigma-AldrichS5761
AlexaFluor 594 HidrazidInvitrogenA10442
NörobiyotinVector LaboratoriesSP1120
ElektrotlarSutter Instrument Co.BF120-69-10
PensFine Science Tools11252-30
Oftalmologik MakasFine Science Tools15000-00
Streptavidin 594InvitrogenS32356
VectashieldVector LaboratoriesH-1000
Keçi SerumuJackson ImmunoResearch005-000-001
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
ParaformaldehitElectron Microscopy Sciences19210

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wassle, H. Parallel processing in the mammalian retina. Nat Rev Neurosci. 5, 747-757 (2004).
  2. Schmidt, T. M., Taniguchi, K., Kofuji, P. Intrinsic and extrinsic light responses in melanopsin-expressing ganglion cells during mouse development. J Neurophysiol. 100, 371-384 (2008).
  3. Huberman, A. D. Genetic identification of an On-Off direction-selective retinal ganglion cell subtype reveals a layer-specific subcortical map of posterior motion. Neuron. 62, 327-334 (2009).
  4. Siegert, S. Genetic address book for retinal cell types. Nat Neurosci. 12, 1197-1204 (2009).
  5. Schmidt, T. M., Kofuji, P. Functional and morphological differences among intrinsically photosensitive retinal ganglion cells. J Neurosci. 29, 476-482 (2009).
  6. Newman, E. A., Bartosch, R. An eyecup preparation for the rat and mouse. J Neurosci Methods. 93, 169-175 (1999).
  7. Haverkamp, S., Inta, D., Monyer, H., Wassle, H. Expression analysis of green fluorescent protein in retinal neurons of four transgenic mouse lines. Neuroscience. 160, 126-139 (2009).
  8. Zhang, D. Q., Zhou, T. R., McMahon, D. G. Functional heterogeneity of retinal dopaminergic neurons underlying their multiple roles in vision. J Neurosci. 27, 692-699 (2007).
  9. Hu, E. H., Dacheux, R. F., Bloomfield, S. A. A flattened retina-eyecup preparation suitable for electrophysiological studies of neurons visualized with trans-scleral infrared illumination. J Neurosci Methods. 103, 209-216 (2000).
  10. Wu, S. M., Gao, F., Pang, J. J. Synaptic circuitry mediating light-evoked signals in dark-adapted mouse retina. Vision Res. 44, 3277-3288 (2004).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

I k Yan t Kaydzole Retina PreparasyonuT m H cre Yama KenetlemeFloresan zleyici EtiketlemeEnzimle Vitreus Uzakla t rmaGenetik Raporlay c FarelerElektrofizyolojik Kay tDendritik Morfoloji AnaliziI k Stim lasyon Yan t

İlgili makaleler