Yöntem makalesi

Mikroenjeksiyon tarafından Memeli Hücreleri mRNA Nükleer İhracat Kinetik Analizi

DOI:

10.3791/2387

⸱

4 Aralık 2010

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Toronto

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada floresan ile birleştiğinde mikroenjeksiyon güç kullanan bir tahlil In situ Memeli somatik hücre mRNA nükleer ihracat kinetiği doğru ölçmek için hibridizasyon.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ökaryotlarda mesajcı RNA (mRNA) çekirdeğinde transkripsiyonu ve sitoplazma çeviri makine erişmek için ihraç edilmelidir. MRNA nükleer ihracat Xenopus oositleri 1 ve maya 2 ve Drosophila elde edilen S2 hücre hattı 3 gibi uysal organizmaların genetik yoğun çalışılan olsa da, memeli hücrelerinde az sayıda çalışma yapılmıştır. Ayrıca memeli somatik hücre mRNA ihracat kinetiği sadece dolaylı olarak 4,5 anlaşılmaktadır. Memeli doku kültürü hücrelerinde mRNA nükleer ihracat kinetiği ölçmek için, floresan in situ hibridizasyon (FISH) ile birleştiğinde mikroenjeksiyon güç kullanan bir test geliştirdiler. Bu deneyleri, memeli hücrelerinde ekleme bağımlı bir şekilde 6,7 mRNA'ların çoğunluğu ihraç ya da sinyal dizisi kodlama bölgesi (SSCR) 6 gibi spesifik RNA dizileri gerektirir şekilde olduğunu göstermek için kullanılmıştır . Bu testte, hücreler, sentezlenen mRNA veya ilgi genini içeren plazmid DNA ya in vitro microinjected . Microinjected hücreler, daha sonra sabit ve RNA alt hücresel yerleşimi BALIK kullanılarak değerlendirildi çeşitli noktalarında inkübe edilir. Transkripsiyon nükleik asitlerin yanı sıra birkaç saat sonra ortaya çıkar transfeksiyon, aksine, DNA veya mRNA mikroenjeksiyon hızlı ifade sağlar ve hassas kinetik verilerin üretimi için izin verir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vitro sentezlenen mRNA veya plazmid DNA, mRNA içine in vivo transkripsiyonu enjeksiyonu; memeli hücrelerinde mRNA ihracat kinetiği ölçmek için kullanılan iki mikroenjeksiyon tabanlı yöntemler vardır . Her tekniğin avantajları ve dezavantajları vardır. Burada her iki tekniğin iki yaklaşım arasındaki farkları anlatmak ve tartışmak.

1. Enjeksiyon için malzemelerin hazırlanması

  1. In vitro transkripsiyonu mRNA
    1. mRNA plazmid veya uygun RNA Polimeraz organizatörü (yani T7 veya SP6 rehberleri) yukarı çevrili ilgi gen içeren PCR ürünleri ya transkripsiyonu. Transkripsiyon in vitro uygun nükleotidler ve aşırı kap analog uygun enzim (T7 veya SP6 RNA Polimeraz, Invitrogen) kullanarak yapılır.
    2. Transkriptler üreticinin protokollere göre Poly-A-Polimeraz (Invitrogen) ve ATP kullanılarak in vitro polyadenylated.
    3. MRNA ya Invitrogen veya Qiagen sütunları kullanarak arındırılır.
    4. Yıkandı, mRNA daha sonra bir saat 30 dakika 4 13.000 g de santrifüj ° C 1/20th hacmi 3M potasyum asetat ve -20 ° C'de% 100 etanol 2 cilt ekleyerek çöktürülür. Fazla sıvıyı varsa, pelet buz% 70 etanol ile yıkanabilir.
    5. Sonucunda mRNA pelet hava enjeksiyon tampon (140mm KCl ve 10mM Hepes, pH 7.4) solubilised kurutulmuş. Herhangi bir kirletici etanol microinjected hücre için toksik olabileceğini unutmayın. Çözünür mRNA -80 ° C'de uzun süreli depolama için tutulabilir.
    6. Mikroenjeksiyon için mRNA enjeksiyon tampon 200μg/ml seyreltilir ve Oregon Yeşil 488 (OG)-konjuge 70kDa dekstran (1mg/ml Invitrogen) ile karıştırılır. RG-konjuge dekstran nükleer gözenek genelinde yayılmak için çok büyük olduğundan, enjekte edilen hücrelerin değil sadece tanımlamak değil, aynı zamanda ne kadar sıvı çekirdeğin içine enjekte edilir ve ne kadar sitoplazma içine sızan belirlemenize yardımcı (sağlayacaktır 4.1.2 bakınız). Alternatif olarak, nükleer gözenek hareket edemiyoruz herhangi bir floresan, yüksek molekül molekül ağırlıklı kullanılıyor olabilir.
    7. Örnekler potansiyel iğne ucu engelleyebilir pelet herhangi bir partikül madde için iğne yüklemeden önce en az 20 dk 4 ° C'de 13.000 g de santrifüj.
  2. Plazmid DNA
    1. Ilgi gen içeren plazmid DNA Qiagen standart DNA arıtma kitleri kullanılarak hazırlanabilir. Genellikle büyük DNA hazırlıkları daha kaliteli olma eğilimindedir ve dolayısıyla daha verimli enjeksiyon sonra transkripsiyonu.
    2. Plazmid DNA RG-konjuge 70 kDa dekstran (1mg/ml) içeren enjeksiyon tampon 200μg/ml 50 seyreltilir.
    3. Enjeksiyon sıvısı iğne yüklemeden önce, en az 20 dk 4 ° C'de 13.000 g de santrifüj edilir.
  3. Mikroenjeksiyon için iğneler
    1. 2.5mm filament Sutter p97 Flaming / Brown Mikropipet Çektirme kullanarak; İğneler 1.0mm borosilikat camdan kılcal tüpler (Dünya Precision Instruments Inc Ürün # 1B100F-3) imal edilir.
    2. Enjeksiyon iğneleri 2.5x4.5 mm kutu filament (madde # FB245B, Sutter Instrument Co) kullanarak üç adım çekme programı kullanılarak oluşturulur. Ancak bu deneyde kullanılan program parametreleri aşağıda listelenmiştir, her filament için optimize edilmesi gerekir.
      # Adım Isı Çekme Hız Zaman Basınç
      1 740 100 8 250 500
      2 740 100 8 250 500
      3 740 100 10 250 500

      (Rampa sıcaklık = 740)
  4. Hücre hazırlık
    1. Genellikle herhangi bir memeli hücre hattı microinjected olabilir, ancak iyi yayılır hücre tipleri enjeksiyon için daha uygun olma eğilimindedirler. Hücre hattı seçimi de diğer faktörlere bağlı olarak değişebilir. Örneğin, endoplazmik retikulum yüzeyinde salgılanan proteinler için kod hedeflenmiş ve bu COS-7 hücreleri çok daha görünür olduğu mRNA'ların NIH 3T3 fibroblastlar ile karşılaştırıldığında 6 (Şekil 3 t-FTZ-Δi mRNA yerelleştirme karşılaştırmak ve 4).
    2. Hücreler 30mm petridishes asit-mikroenjeksiyon için en az 24 saat önceden yıkanmış kare lamelleri (25x25mm) numaralı seribaşı olmalıdır. Bazı hücre hatları, yayılma fibronektin kaplı lamelleri 6,8 kaplama hücreleri tarafından teşvik edilebilir. İdeal olarak, hücresel bir tek tabaka enjeksiyon zaman kabaca% 70-90 konfluent olmalıdır.
    3. Enjekte edilen hücrelerin kolay tanımlama için izin vermek için, hücre tek tabakalı bir 200μl plastik pipet kullanarak enjeksiyondan önce yaralı. Genellikle çapraz yara (Şekil 1) lamel kazınmış ve hücrelerin en az 15 dakika önce doku kültürü inkübatör enjeksiyon kurtarmak için bırakılır.
    4. Mikroenjeksiyon sırasında, doku kültürü ortamı yavaş yavaş difüzyon CO 2 kaybeder ve sonuç alkali hale gelir . Enjeksiyon sırasında bir nötr pH korumaya yardımcı olmak için, medya 10mM Hepes pH 7.4 ile desteklenebilir. Ekstra tampon medya mikroenjeksiyon önceki gün eklenebilir.
  5. Mikroskop ve Mikromanipülatör
    1. Hücreler mikroenjeksiyon işlemi için yıkıcı olabilir titreşimleri en aza indirmek için bir hava tablo izole bir inverted mikroskop kullanarak microinjected. Mikroskop iki amacı ile donatılmıştır; hücreleri ve iğne konumlandırmak için kullanılan bir kuru 10x parça ve görüntü mikroenjeksiyon işlemi için kullanılan bir kuru 40x ekstra uzun çalışma mesafesi faz amacı,.
    2. Objektif bir düzeltme yaka varsa lamel ve petridish çapında izleme hücreleri tarafından neden Optik sapmaları ortadan kaldırılabilir. Mikroskop aydınlık düzgün Köhler aydınlatma 9 uyumlu olduğunu sağlanması, aynı zamanda bir iğne (bkz. 2.2.4) tarafından dağınık ışık kaynaklanan sapmaları için doğru yardımcı olacaktır .
    3. Iğne, üç eksenli bir joystick mikromanipülasyon asılı cihazı (NT-88-V3MSH Narishige) tarafından kontrol edilir. Kaba manipülatör özgün konumunu korurken iğne çanak içine kolayca kaldırdı ve düşürülmelidir için izin mikroskop arka ayağını güvence altına alınmıştır.
    4. İğne, kaba manipülatör kenetli bir değnek güvence altına alınmıştır. Mikroenjeksiyon iğne ucundan sıvı çıkarmak için gerekli enjeksiyon basıncı üretir, bir tüp, bir 5cc cam şırınga (Becton Dickinson Ürün # 512.311) değnek bağlanır. Basıncı seviyesi kontrol etmek için, iki tapalar, boru kelepçesi (herhangi bir donanım deposu mevcut) ve iki adet metal kelepçe (Şekil 2) oluşan bir şırınga regülatörü tarafından şırınga varil ve piston pozisyonda tutulur. Şırınga pistonu şırınga yüksek basınç, vakum gres (Dow Corning) koruyacağından emin olmak için uygulanır.
  6. Floresan Hibridizasyon Prob
    1. Enjekte edilen nükleik asit birincil dizisi RNAstructure 4.6 10 gibi RNA ikincil yapı tahmini yazılım, katlanmış.
    2. MRNA kıvrımları gibi uzun çift iplikçikleri gibi yüksek erime sıcaklıkları, ikincil yapılar serbest olma eğilimindedir, yaklaşık 50 nükleotid bir bölgeyi tanımlamak için görsel olarak değerlendirilir.
    3. Bu bölgenin ters tamamlayıcı probun 5 'sonuna kadar bağlı bir Alexa546 fluorofor sentezlenir (Integrated DNA Technologies satın alınabilir).
    4. Prob 100μM bir konsantrasyonda su ile seyreltilir ve 2-3 yıl boyunca -80 ° C'de saklanır.

2. Intranükleer Mikroenjeksiyon

  1. Mikroenjeksiyon mikroskop enjeksiyon sıvısı yükleme
    1. Enjeksiyon sıvısı yaklaşık 1μl kullanarak santrifüj DNA veya mRNA örnek çizilirGELoader ipuçları (Ürün # 022.351.656; Epindorff). Sıvı iğne yapışmasına neden olabilir partikül madde içeren pelet bozmamak için örnek üst aspire edilmelidir.
    2. Pipet ucu, arka uç iğne yerleştirilir ve sıvı atılır. Sıvı iğne ucu kapiler eylem tarafından çizilmiş olacak ve ucuna yakın bir menisküs 5-30sn içinde görünür olmalıdır.
    3. Sıvı dolu iğne, değnek, daha sonra 45 derecelik bir açıyla mikromanipülatör kenetli eklenir.
    4. İğne 10x objektif ile görüntülendi ve görüntüleme uçağın kaba mikromanipülatör düğmeleri kullanarak odak düzlemi yakınında merkezi bir konuma sahiptir. İğne sonraki adımlarda (2.2.2) hasar görmesini ve daha sonra mikroskop arka ayağı geri itilir önlemek için birkaç milimetre sonra ortaya çıkar.
    5. Basınç, piston 0.5-2CC karartıcı artar.
  2. Mikroenjeksiyon
    1. Yaralı bir tek tabakalı bir kapak kayma içeren bir petridish görüntüleme sahnede yer alır.
    2. Mikroskop arka ayağı uyumlu hale getirilmesi ve iğne kondenser sıvı girmek için neden dik bir pozisyonda öne çekilir. Bu, (2.1.4) lamel üzerine kırılmasını iğne önlemek için dikkatli bir şekilde yapılmalıdır.
    3. 10x objektif kullanarak, çapraz yara merkezi tanımlanır ve iğne enjekte edilecek hücreler üzerinde konumlandırılmış.
    4. Büyütme 40x objektif anahtarlama ve iğne joystick ince ayar düğmeleri kullanarak indirdi ve ortalanır artar. Görüntü odak dışında ise, tek bir Bertrand lens ile (1.5.2) (yani Kölher aydınlatma 9) ışık düzgün hizalı olduğundan emin olmanız gerekir.
    5. Enjeksiyon yara çapraz bir köşesinde başlar ve görselleştirme sırasında enjekte edilen hücrelerin (bkz. Şekil 1) kolay tanımlama için bir kenarı boyunca devam olmalıdır.
    6. İğne çekirdeği ile temas kurmaya indirilir. Bir enjeksiyon eşlik faz parlaklığı önemli değişiklik kolay bir hücre enjekte edildiğini söyleyebilirim.
    7. Tüm hücre sıvısı doldurur basıncı çok yüksek olduğu ve alçaltılmış olması gerekir gösterebilir.
    8. Faz parlaklık herhangi bir değişiklik tespit edilirse, bu mikroenjeksiyon basınç ya da hücre zarı delmek için yeterince güçlü değildir, ya da iğne ucu tıkalı olduğunu gösterebilir. Yetersiz basınç, iğne kusurları ve küçük partikül madde ile iğne ucu tıkanması: Bu konular da dahil olmak üzere bir dizi sonucu olabilir. Mikromanipülatör her iğne yükleme beri zaman alıcıdır ve enjeksiyon substrat genellikle çok değerli olduğundan, etkili enjeksiyon için kullanılan iğneler oranını en üst düzeye çıkarmak için önemlidir. Aşağıda bir adım-adım rehber tarafından tıkanmış bir iğne ucu engelini kaldırmak için çalışıyoruz. Her adımdan sonra, bir tıkanıklığı kaldırıldı olup olmadığını değerlendirmek için 2-3cells enjekte denemelisiniz:
      Eylem Amaç ve Hedef
      1 Iğne ucu uzunluğu odağı ayarlayın. Iğne veya ucu engelleme partikül büyük bir parçası olup olmadığını bariz bir eksiklik olup olmadığını belirlemek için.
      2 Çanak partikül yüzen bir parça yanında iğne ucu yerleştirin. Sıvı ucu çıkarken, iğne ile doğrudan temas olmadan parçacık ajitasyon gerekir.
      3 Sonuna kadar şırınga pistonu sıkıp Bu geçici basınç artışı ucunda herhangi bir engeli temizlemek gerekir. Pistonu serbest bıraktıktan sonra, kendi isteği üzerine yükselmeye; değilse, bu demektir basınç şırınga içinde yerleşik olmayan ve sıkın bağlantıları ve / veya ek vakum yağ eklemek gerekir.
      4 Hücre med iğne dışarı kaldırınia Sulu ortamda iğne çizim güç iğnenin ucunda engel yerinden yardımcı olabilir.
      5 Şırınga pistonu tamamen çıkarın ve tekrar takın. Bu ek basınç artışı iğne ucu temizlemek için gerekli olabilir.
      6 Lamel temiz bir kısmında iğne ucu Scratch Bu da iğne içinde partikül heyecanlandırmıyor ucundaki tıkanıklığı gidermek için yeniden konumlandırmak yardımcı olur. Güçlü tırmalama, iğne çıkmak için tıkanıklığı sağlayan ucu dışına çip olabilir.
      7 Yük yeni bir iğne


      Başka bir yaygın sorun, şırınga pistonu daha karartıcı sık tazminat gerektiren kademeli iğne içinde basınç kaybı. Genellikle, şırınga pistonu ek vakum yağ ekleyerek daha tutarlı basınç sürdürülmesine yardımcı olabilir. Ancak bu sorun sızıntıları şırınga ve tüp, tüp ve değnek ya da çubuk ve iğne arasındaki bağlantıları nedeniyle olabilir. Değnek ve iğne arasındaki sızıntıları sadece değnek lastik conta değiştirerek düzeltilmiş olmasına rağmen, en çok hava kaçağı, gerekirse Parafilm (Balıkçı) veya gres kullanılarak kapalı olabilir.
    9. Bir yara kenarı boyunca Hücreler zaman sabit bir süre için (10-15dk) yara kenarı boyunca microinjected. Uygulama ile birkaç yüz hücreleri bu aralık sırasında enjekte edilebilir.
    10. Mikroenjeksiyon sonra, hücreler 37 inkübe ° C fiksasyon için önce zaman istenilen miktarda doku kültürü inkübatör. Büyüme ortamı içinde çözünmüş; DNA enjekte varsa, transkripsiyon, α-amanitin (Sigma-Aldrich 1μg/ml) hücreleri tedavi 20dk sonra sona erer. Bu yoğunlaşma etkili microinjected plazmid (Şekil 3) transkripsiyonunu inhibe eder.
    11. Rağmen, tek bir iğne iğne microinjected olduğunu DNA veya RNA tipi bir değişiklik değiştirilmesi gerekir, birden fazla lamelleri enjekte yeniden kullanılabilir. İğnenin değnek kaldırılır imha ve yeniden olması gerekir.
    12. Ölü ya da yüzer hücreler iğne ucu zaman zaman sopa ve mikroenjeksiyon ile karışabilir. Iğneden bu enkaz kaldırmak ayağı geri iterek sıvı iğne yükseltmek ve daha sonra yavaş yavaş sıvı içine iğne geri dik pozisyonda direği tekrar ayarlanmasına yeniden takın.
    13. MRNA nükleer ihracat kinetik ölçüm doğru bir ölçüm elde etmek için, ayrı örnekler, 0min sabit olmalıdır 15dk, 30dk, 60dk ve 120dk post-RNA mikroenjeksiyon veya α-amanitin tedavi sonrası.

3. Hücre Fiksasyon ve Boyama

  1. Hücre Sabitleme ve Permeabilization
    1. Uygun zamanda, büyüme ortamı aspire edilir ve hücreler 2 ml PBS solüsyonu (137mm NaCl, 2.7mm KCl, 10mM Na 2 HPO 4, 2mm KH 2 PO 4, pH 7.4) ile iki kez yıkanır. Pompalarında olan zamanı en aza indirerek lamelleri nemli tutmak önemlidir.
    2. Hücreler PBS içinde% 4 paraformaldehid (Elektron Mikroskobu Bilimleri) oda sıcaklığında en az 15 dakika için 2 ml ekleyerek sabitlenir.
    3. Sabit örnekleri PBS çözüm ile iki kez yıkanır.
    4. Hücreler 2ml 0.1% permeabilize oda sıcaklığında en az 15 dakika süreyle PBS içinde Triton X-100.
    5. Örnekleri PBS ile iki kez yıkanır.
  2. BALIK Boyama
    1. Sonraki örnekleri hibridizasyon için hazırlıklı olması gerekiyor. Hücreleri 1x SSC çözümü (150mm NaCl, 15mm sodyum sitrat, pH 7.0)% 25-60 formimide ile iki kez yıkanır. Formamid miktarı için, aynı konsantrasyon (3.2.3) hibridizasyon çözüm kullanın.
    2. 150mm petridish alt boyama odası hazırlamak için, su ile kaplıdır ve Parafilm bir parça su üzerinde yüzen. Parafilm çanak alt uymak izin böylece, çanak dönüm su tarafından kaldırılır. Hava kabarcıkları elle yenidentaşındı.
    3. Her lamel için hibridizasyon çözüm lekeli, 100μl damla (% 25-60 formamid, 100mg/ml dekstran sülfat, 1mg/ml E. coli tRNA, prob 1:500 sulandırılmış 1x SSC 5mM vanadyl riboside kompleksi) pipetlenir parafilm üzerine. Formamid, miktarı, kullanılan özel FISH probu için optimize edilmiş olması gerektiğini unutmayın.
    4. Forseps yardımı ile lamel sonra ön yüzünde sabit kurutma olmadan kötülerin Whatman filtre kağıdı (VWR) lamel arka tarafında (hücre tarafı), kuru ve aşırı tampon kullanarak, bir 30mm petridish kaldırılır hücreleri. Lamel sonra BALIK çözümü üzerine yüzü aşağı gelecek şekilde yerleştirilir. Bu her lamel için tekrarlanır.
    5. Boyama haznesi kapağını geri koyduktan sonra, numuneler, 37 ° C'de 5-18hrs inkübe
  3. Vitray Örnekleri Yıkama ve Montaj
    1. Birkaç çamaşır odaları boyama odasında aynı şekilde (3.2.2) yapılır.
    2. Her lamel için, 1 ml yıkama tamponu (25-60% formamid 1x SCC) çamaşır odasının parafilm üzerine pipetlenebilir. Yine, (3.2.3) hibridizasyon çözüm mevcut formamid aynı konsantrasyon kullanın.
    3. 1 ml yıkama tamponu boyama odasından lamelleri kaldırmak için lamel sonraki pipetlenir. Sıvı kapiler eylem her numune altına çizilmelidir.
    4. Forseps kullanarak lamelleri kaldırılır ve her damla yıkama tamponu yerleştirilir ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe.
    5. 3.3.2 için 3.3.4 Adımlar her lamel toplam 3 kez yıkanır, böylece iki kez daha tekrarlanır.
    6. RNA bazı protein ile immünofloresan costained olması ise, bölüm 3.4 'e bakınız.
    7. Slaytlar% 70 etanol ile yıkanır ve Kimwipes ile kurutulur. Her lamel için DAPI (Fluoromount G, Güney Biotech) ile çözüm montaj 10-30 ul Slaytlarınıza pipetlenir. Her slayt iki lamelleri barındırabilir.
    8. Lamelleri arka forseps ve Whatman filtre kağıdı kullanarak, kurutulur ve aşırı sıvı örnekleri kurutma olmadan lamel ön tarafı kapalı kötülerin. Her lamel sonra açılan montaj çözümü üzerine yüzü aşağı gelecek şekilde yerleştirilir.
    9. Atlı örnekleri, 4 mağaza olabilir ° C
  4. İmmünofloresan Boyama
    1. Numuneler uygun antikor boyama ile karışabilir formamid kaldırmak için PBS ile iki kez yıkanmalıdır.
    2. Birincil antikor çözeltisi (1.0μg/ml antikor,% 0.1 TX-100, PBS içinde 0.1mg/ml RNAse ücretsiz BSA) 50μl her lamel için, bir çamaşır odasının parafilm üzerine pipetlenir.
    3. Lamelleri, forseps kullanarak birincil antikor çözümü üzerine hücre tarafına yerleştirilir ve 30 dakika oda sıcaklığında inkübe için izin.
    4. Her lamel, PBS iki 1ml damla çamaşır odasının parafilm üzerine pipetlenir.
    5. Antikor boyama çözüm lamelleri kaldırmak için, 1 ml PBS lamel sonraki pipetlenir. Sıvı kapiler eylem her numune altına çizilmelidir.
    6. Forseps kullanarak lamelleri kaldırılır ve her yerleştirilir 5min PBS ilk damla üzerine ve daha sonra başka bir 5min PBS ikinci damla üzerine yerleştirilir.
    7. Adımlar 3.4.2 için 3.4.6 ikincil floresan antikor çözeltisi (1.0μg/ml antikor,% 0.1 TX-100, PBS içinde 0.1mg/ml BSA) kullanarak tekrarlanır. Enjeksiyon işaretleyici ve RNA, yeşil ve kırmızı kanal görünür olduğundan, ikincil antikor gibi Alexa647 gibi uyumlu bir boya ile konjuge olması gerektiğini unutmayın.
    8. Lameller 3.3.7 içinde monte edilmiştir.

4. Görüntüleme ve Niceleme

  1. Görüntüleme
    1. Epifloresans mikroskop görüntü enjeksiyonu takiben hücreler için kullanılır. Enjekte hücreleri çapraz yaralar bulma ve hücreleri enjekte işaretleyici (RG-dekstran) ile tespit bulunabilir.
    2. Gözlenen her bir hücre için, enjekte edilen RG-dekstran bir resim elde edilir. Görüntüleme mRNA microinjected kantifikasyon çekirdeğin içine enjekte edilen sıvı (yani dekstran)>% 90 aldı hücrelere sınırlı olduğu zaman önemlidir.
    3. RNA bir görüntü elde edilir. RNA doğru ölçümü için izin vermek için, belirli bir zaman akışı içinde tüm hücreleri arasındaki pozlama süresi fotoğraf makinesinin dinamik aralığı içinde sabit ve sonbahar kalmalıdır. İdeal olarak her görüntünün uygun arka plan floresan inte hesaplamak mümkün uninjected hücre içermelidirnsity (4.2.4).
    4. Miktarının belirlenmesinde yardımcı olacak, leke DAPI bir görüntü de elde edilebilir. Ayrıca, immünofloresan yapılan ise lekeli protein de görüntülü olabilir. Bir zaman içerisinde çeşitli noktalarda mRNA dağılımının bir örnek Şekil 4'te gösterilmiştir. MRNA salgılanan bir protein kodlar ve böylece COS-7 hücreleri ER hedeflenmektedir. ER hedefleme co-boyama TRAPα, yerleşik ER protein 11 karşı antikorlar ile RNA tarafından doğrulanmadı olduğunu unutmayın.
  2. Niceleme

    Değişik görüntü analiz yazılımı paketlerinin sayısı ile yapılabilir. ImageJ yazılımı elle nükleer ve sitoplazmik kesirleri ayırmak için kullanılan olabilir çünkü hücresel mRNA dağıtım ölçülmesi için çok uygundur, bu fraksiyonların ortalama floresan ölçebilir ve çıkış verileri gibi kolaylıkla kopyalanabilir ve diğer yazılım yapıştırılabilir. Microsoft Excel.
    1. BALIK, RG-dekstran ve DAPI floresan karşılık gelen Görüntüler açıldı ve aracı Stack Images kullanarak birleştirilir.
    2. DAPI veya dekstran katman Eşik aracı microinjected çekirdeğine karşılık gelen alanda izole etmek için kullanılır. Bu fraksiyonu Değnek aracını kullanarak seçilir ve BALIK katmanı, alan (A Nük) ve (F Nük) yoğunluğu ortalama / ortalama taşıdıktan sonra Ölçü aracı kullanılarak kaydedilir.
    3. Hücre çevre Freehand seçim aracını kullanarak ana hatları ve BALIK katmanı alan (A Tot) ve (F Tot) ortalama yoğunluğu / ortalama Ölçü aracı kullanılarak kaydedilir. Cep floresan arka planda daha anlamlı daha yoğun ise, Eşik aracı yerine istenilen hücre anahat Freehand seçim aracı kullanabilirsiniz.
    4. Dikdörtgen seçim fonksiyonunu kullanarak, bir kutu, bir uninjected hücre ve / ortalama ortalama yoğunluğu (F Geri) üzerine çizilir .
    5. Tüm ölçümler bir excel çalışma sayfasına kopyalanır.
    6. İhraç mRNA aşağıdaki eşitlik kullanılarak hesaplanır:
      figure-protocol-1
      Bir Nük Çekirdeğin Alanı
      Bir Tot Tüm hücre Alanı
      F Nük Nükleer fraksiyonu ortalama floresan
      F Tot Tüm hücre fraksiyonu ortalama floresan
      F Geri Untransfected bir hücre ortalama floresan

      Her zaman noktası için ortalama% İhracat hesaplanır ve zaman içinde çizilmiştir.
    7. zamanla mRNA İstikrar ortalama toplam mRNA floresan (F Geri) A Tot x (F Tot) planlamakla hesaplanır. Genelde biz mRNA miktarı, hücreler arasında ve lamelleri arasında büyük ölçüde değişir. Bu BALIK boyama, iğne akış oranları arasındaki ve verimlilik arasındaki tutarsızlıklar nedeniyle olabilir.

figure-protocol-2
Şekil 1. 200μl plastik pipet kullanarak dikey ve yatay olarak yaralı% 70-90 konfluent kadar Mikroenjeksiyon lamel. Hücreleri yetiştirilmektedir. Çapraz yara itibaren bir yara kenarı boyunca (ok), hücreler enjekte edilir.

figure-protocol-3
Şekil 2 Şırınga regülatörü. A) Akış diyagramı şırınga regülatörü nasıl monte edilir göstermektedir. B) Şematik monte aparatı. C) monte şırınga regülatör bir fotoğraf.

figure-protocol-4
Şekil 3. Α-amanitin enjekte plazmid DNA transkripsiyon Etkileri konsantrasyon değişen önceden tedavi edildi NIH3T3 fibroblast hücreler,α-amanitin s, t-FTZ-Δi plazmid DNA ve RG-konjuge 70kD dekstran ile enjekte edildi. Enjekte hücreleri 37 inkübe edildi ° C 1 saat sonra t-FTZ-Δi mRNA için belirli bir BALIK probe6 kullanarak sabit ve boyandı. Her satır, RG-70kDa dekstran ve t-FTZ-Δi mRNA için görüntülü görünümün tek bir alanına tekabül eder. Yüksek, ancak düşük değil, ilaç konsantrasyonlarının t-FTZ-Δi transkript üretimi tamamen inhibe etmiştir. Ölçek çubuğu = 15μm.

figure-protocol-5
figure-protocol-6
Şekil 4. MRNA nükleer ihracat Zaman kursu t-FTZ-Δi plazmid DNA ve RG-konjuge 70kD dekstran COS-7 hücreleri enjekte edildi. 30dk aşağıdaki enjeksiyon hücreleri α-amanitin ile tedavi edilen, 37 ° C'de belirtilen zaman noktaları için inkübe edildi. Bu hücreler daha sonra sabit ve prob ile t-FTZ-Δi mRNA karşı ER işaretleyici TRAPα karşı antikor ile boyandı. Her satır tek bir hücre alanına tekabül eder. A) mRNA dağıtım mikroenjeksiyon timecourse. B) (A) 120dk bir zaman noktasında bir darbe t-FTZ-Δi mRNA ve ER eş-lokalizasyon göstermektedir. T-FTZ-Δi mRNA (yeşil) ve TRAPα (kırmızı) ile boyanarak bir kaplama sağ panelinde gösterilir. Ölçek bar = 15μm.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroenjeksiyon farklı hücresel süreçlerin bir dizi çalışma için kullanılan güçlü bir araçtır. Geleneksel hücre transfeksiyon aksine, mikroenjeksiyon, araştırmacı, çok dar bir zaman dilimi içinde etkili bir şekilde hücresel çekirdek içine nükleik asitlerin tanıtmak sağlar. Sonuç olarak, bir mRNA ihracat mRNA yerelleştirme ve protein sentezi oranlarının belirlenmesinde gibi kinetik analizler gerçekleştirebilirsiniz. Ayrıca, deney zaman dilimi nispeten kısa olduğundan, bir pleiotropik etkileri ödemeden kısa zaman dilimlerine içinde hücreleri toksik bileşikleri açığa çıkarabilir. Dahası, dominant negatif proteinler gibi inhibitör veya uyarıcı bileşikler, nükleik asitler ile eş-enjekte edilebilir. Son olarak, microinjections genellikle hücreleri için toksik ve farklı hücresel fonksiyonları karıştırmayı transfeksiyon reaktifler, gereksinimini ortadan kaldırmak.

plazmid DNA enjeksiyonları vs mRNA

Nükleik asit enjekte etmek için bir takım hususlar bağlıdır hangi seçim. Plazmid DNA enjeksiyonundan sonra, RNA Polimeraz II mRNA sentezler, aynı zamanda doğmakta olan transkript 12,13 protein faktörleri acemi değil sadece. Bu faktörlerin mRNA işlenmesi, nükleer ihracat ve sitoplazmik lokalizasyon gibi olayları yöneten, plazmid DNA enjeksiyonu transkripsiyon downstream prosesler birleştiğinde nasıl değerlendirmek için kullanılabilir. Transkripsiyon nükleer ihracat 14 birleştiğinde olabilmesine rağmen, biz enjekte mRNA transkripsiyonu mRNA in vivo 6 daha biraz daha hızlı ihraç olduğunu bulduk. Bunun nedenleri şu anda net değil, ancak bu sonucu olarak yeni sentezlenen mRNA RNA Polimeraz II çıkar önerebilir, bu geciktirir nükleer ihracat kompleksleri kadar bağlı olabilir.

MRNA enjeksiyonları ile bazı avantajları vardır. İlk olarak, araştırmacı hücrelerin RNA genel metabolizmasını düzenleyen nasıl etkileyebilir, RNA Polimeraz inhibitörleri kullanmak zorunda değildir. İkincisi, RNA enjeksiyondan önce, in vitro olarak değiştirilmiş olabilir. Örneğin, mRNA'ların, bu özellikleri nükleer ihracat 6 nasıl etkilediğini değerlendirmek için çeşitli 5 'şapka analogları veya poli (A) kuyruk uzunlukları ile sentezlenmiş olabilir . Üçüncüsü, enjekte edilir RNA tam miktarı kabaca tahmin edilebilir. Yukarıda belirtilen protokol sonrasında, tipik bir memeli hücre (400,000 850,000 molekülü) 15 transkript toplam sayısı ile kıyaslandığında, nispeten küçük her çekirdek, yaklaşık 20.000 ila 50.000 moleküller enjekte olduğunu tahmin ediyoruz . MRNA enjeksiyonu ile en büyük dezavantajı, mikroenjeksiyon sırasında, sitoplazma içine enjeksiyon sıvısının bazı kaçak kaçınılmaz olduğunu. Sitoplazma içine doğrudan enjekte mRNA (A. Palazzo, basılmamış gözlem) üzerinde uzun süre sabit olduğundan, ekstra bakım hücreleri sayısal seçmek için alınmalıdır. Genellikle enjeksiyon sıvısı>% 90 olarak RG-dekstran dağılımı ile değerlendirildi çekirdeği, alınan hücrelerin analiz eder.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz, bize çeşitli ekipman kullanımı için izin verdiği için faydalı öneri ve A. Wilde E. Gomes teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırmaları (FRN 102.725) Enstitüsü AFP bir hibe ile desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Enjeksiyon tamponuSigma-Aldrich140 mM KCl ve 10 mM HEPES, pH 7.4
Oregon Green 488-70kD DekstranInvitrogenD7173Enjeksiyon tamponu içindeki 10mg/ml stok, -80°C'de uzun süreler boyunca saklanabilir
Borosilikat kapiler tüplerWorld Precision Instruments, Inc.1B100F-4
Enjeksiyon iğnelerini doldurmak için jel yükleme pipet uçlarıEppendorf022351656
MikroskopNikon InstrumentsEclipse Ti-S
MikromanipülatörNarishige InternationalNT-88-V3MSH
Enjeksiyon şırıngasıBD Biosciences512311
PBS TamponuSigma-Aldrich137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4
SSC TamponuSigma-Aldrich150 mM NaCl, 15 mM sodyum sitrat, pH 7.4
%4 ParaformaldehitElectron Microscopy Sciences15686%37 Paraformaldehit stok çözeltisi PBS ile seyreltilir
%0.1 Triton X-100 (Surfact-Amps)Thermo Fisher Scientific, Inc.28314%10 Triton X-100 stok çözeltisi PBS ile seyreltilir
FormamidFisher ScientificF84-1
Dekstran sülfatFisher ScientificBP1585-100
E. coli tRNASigma-AldrichR1753
Vanadil ribozid kompleksi (VRC)Sigma-AldrichR3380
Whatman filtre kağıdıVWR international28298-020
Titreşim kontrol masasıKinetic Systems5702E-3036-21
Fluoromount GSouthernBiotech0100-20
α-amanitinSigma-AldrichA2263
ParafilmFisher Scientific13-374-12
Alevli/Brown Mikropipet ÇekiciSutter Instrument Co.P-97
Vakum GresiDow Corning695400008
T7 RNA PolimerazNew England BiolabsM0251S
Poly(A) PolimerazAmbionAM1350
Hibridizasyon TamponuSigma-Aldrich100mg/ml dekstran sülfat, 5mM VRC, 150mM NaCl, 15mM sodyum sitrat, 0.5mg/ml E. coli tRNA, %60 formamid

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Luo, M. J., Reed, R. Splicing is required for rapid and efficient mRNA export in metazoans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 14937-14942 (1999).
  2. Bossie, M. A., Silver, P. A. Movement of macromolecules between the cytoplasm and the nucleus in yeast. Curr. Opin. Genet. Dev. 2, 768-774 (1992).
  3. Farny, N. G., Hurt, J. A., Silver, P. A. Definition of global and transcript-specific mRNA export pathways in metazoans. Genes Dev. 22, 66-78 (2008).
  4. Audibert, A., Weil, D., Dautry, F. In vivo kinetics of mRNA splicing and transport in mammalian cells. Mol. Cell. Biol. 22, 6706-6718 (2002).
  5. Snaar, S. P., Verdijk, P., Tanke, H. J., Dirks, R. W. Kinetics of HCMV immediate early mRNA expression in stably transfected fibroblasts. J. Cell. Sci. 115, 321-328 (2002).
  6. Palazzo, A. F. The signal sequence coding region promotes nuclear export of mRNA. PLoS Biol. 5, e322-e322 (2007).
  7. Valencia, P., Dias, A. P., Reed, R. Splicing promotes rapid and efficient mRNA export in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3386-3391 (2008).
  8. Palazzo, A. F., Eng, C. H., Schlaepfer, D. D., Marcantonio, E. E., Gundersen, G. G. Localized stabilization of microtubules by integrin- and FAK-facilitated Rho signaling. Science. 303, 836-839 (2004).
  9. Keller, H. E. Proper alignment of the microscope. Methods Cell Biol. 72, 45-55 (2003).
  10. Mathews, D. H. Incorporating chemical modification constraints into a dynamic programming algorithm for prediction of RNA secondary structure. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7287-7292 (2004).
  11. Görlich, D. The signal sequence receptor has a second subunit and is part of a translocation complex in the endoplasmic reticulum as probed by bifunctional reagents. J. Cell Biol. 111, 2283-2294 (1990).
  12. Perales, R., Bentley, D. "Cotranscriptionality": the transcription elongation complex as a nexus for nuclear transactions. Mol. Cell. 36, 178-191 (2009).
  13. Buratowski, S. Progression through the RNA polymerase II CTD cycle. Mol. Cell. 36, 541-546 (2009).
  14. Maniatis, T., Reed, R. An extensive network of coupling among gene expression machines. Nature. 416, 499-506 (2002).
  15. Carter, M. G. Transcript copy number estimation using a mouse whole-genome oligonucleotide microarray. Genome Biol. 6, 61-61 (2005).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mikroenjeksiyon AnaliziFloresan n Situ HibridizasyonMemeli Doku K lt rPlazmid DNA EnjeksiyonuRNA Lokalizasyon AnaliziSitoplazmik Floresans KantifikasyonuAlfa Amanitin UygulamasFloresans Mikroskopi G r nt leme

İlgili makaleler