Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Beyin organoidine etiketli hücre enjeksiyonu
NOT: Bu kağıt için, serebral organoidler, üreticinin talimatlarına göre ticari bir kit kullanılarak üretilmiştir. Bu, ilgilenilen serebral organoid ile değiştirilebilir. Protokolün bu bölümünde kullanılan malzemeler, çözündürülmüş bazal membran matrisinin 4 °C'nin üzerindeki sıcaklıklarda jelleşmesini önlemek için önceden soğutulmalıdır.
- Çözünmüş bazal membran matrisi ile temas edecek insülin şırıngalarını, uçlarını ve tüplerini soğumaları için -20 °C'ye yerleştirin.
- Gerçekleştirilecek enjeksiyon sayısına bağlı olarak (~ 2 μL / enjeksiyon) uygun boyutta çözünmüş bazal membran matrisinin uygun boyutta bir alikotunu buz üzerinde çözün. Bu işlem yaklaşık 30 dakika sürer.
- Alikot çözülürken, hücreleri bölün, hasat edin ve sayın.
- Enjeksiyon başına gereken hacimleri hesaplayın. Birden fazla enjeksiyon yapıyorsanız, toplam hücre hacmini 1,5 mL'lik bir tüpe yerleştirin ve 1 mL'ye kadar DMEM/F12.
ekleyinNOT: Kayıpları/pipetleme hatalarını hesaba katmak için birkaç ekstra enjeksiyona izin veren bir hacim kullanılmalıdır. - Sonraki adımlar hazırlanırken hücreleri buza yerleştirin.
- Çözüldükten sonra, çözündürülmüş bazal membran matrisini buz gibi soğuk DMEM/F12'de 3 mg/mL'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin.
- Tek hücreli süspansiyonu buzdan alın ve 300 × g'da 5 dakika boyunca 4 °C'de döndürün.
NOT: Soğutmalı bir santrifüj mevcut değilse, oda sıcaklığında döndürme genellikle tolere ediliyor gibi görünmektedir. - Hücre peletini bozmadan ortamı nazikçe tamamen çıkarın. Gerçekleştirilecek enjeksiyon başına 2 μL'lik bir nihai hacim elde etmek için seyreltilmiş çözündürülmüş bazal membran matrisinde (3 mg / mL) nazikçe pipetleme yaparak hücre peletini yeniden süspanse edin ve kullanıma kadar hemen tekrar buzun üzerine yerleştirin.
NOT: Kabarcık oluşumunu ve jelleşmeyi önlemek için hücrelerin yeniden süspansiyonunun yavaşça ve önceden soğutulmuş uçlarla yapılması gerekir. - Önceden soğutulmuş şırınga(lar)ı -20 °C dondurucudan bir buz kovasına aktarın. Kullanana kadar orada tutun.
- Beyin organoidlerinin bulunduğu plakayı inkübatörden çıkarın. Enjekte edilecek organoidi 35 mm'lik bir tabağa aktarmak için geniş delikli bir uç kullanın. Organoidi stabilize etmek ve enjeksiyonu kolaylaştırmak için organoide zarar vermeden mümkün olan tüm ortamı çıkarın.
NOT: Organoidin tahrip olmasını önlemek için geniş delikli uçlar kullanmak önemlidir. Mevcut değilse, normal bir P1.000 ucunun ucunu steril makasla kesin. - Enjeksiyonu yönlendirmeye ve kolaylaştırmaya yardımcı olmak için organoidi içeren 35 mm'lik çanağı bir diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin.
NOT: Steril bir alanda diseksiyon mikroskobu yoksa, biraz azaltılmış kontrolle de olsa, enjeksiyonu diseksiyon mikroskobu olmadan gerçekleştirmek mümkündür. Diğer bir alternatif, bir büyütme halkası veya gözlük kullanılmasıdır. - Organoid(ler) enjekte edilmeye hazır olduğunda, hücreleri soğutulmuş bir P20 pipet ucuyla nazikçe yeniden süspanse edin ve 2 μL'yi (enjekte edilecek istenen sayıda hücreyi içeren) önceden soğutulmuş steril bir cam slayt üzerine hareket ettirin.
NOT: Çoklu enjeksiyonlar için, cam slayt boyunca 2 μL'lik ek bir hacim eklenebilir. Buz üzerinde tutun ve buharlaşmamaya dikkat edin. - Buzdan önceden soğutulmuş bir insülin şırıngası alın ve tüm hücrelerin/ortamın alınmasına izin vermek için iğnenin eğimi aşağı bakacak şekilde 2 μL hücre süspansiyonunu yavaşça yukarı çekin.
NOT: Herhangi bir hava çekmemek için son derece yavaş gittiğinizden emin olun. - Organoid içeren tabağın kapağını açın ve mikroskobu üzerine odaklayın. Çanağı bir elinizle tutun. İğnenin eğimini yukarı yerleştirin ve diğer elinizle hücreleri yavaşça organoid yüzeye enjekte edin.
NOT: Dokuya zarar vermemek için yavaş enjekte etmek önemlidir. - Enjeksiyondan sonra, kapağı tekrar tabağa yerleştirin ve enjekte edilen organoidin 1-2 dakika bekletilmesine izin verin.
NOT: Bu, seyreltilmiş, çözündürülmüş bazal membran matrisinin jelleşmesini ve hücreleri yerinde tutmasını sağlar. Ortam çok erken eklenirse, yüzeyde oturan hücreleri yıkayabilir. - Yavaşça 500 μL organoid ortam ekleyin ve organoidi geniş delikli bir uçla 24 oyuklu bir plakanın kuyusuna aktarın. Organoidi gece boyunca 37 ° C ve% 5 CO2'de inkübe edin. Her iki günde bir tam ortam değişiklikleri gerçekleştirin.
NOT: Görüntüleme ayarlamaları için kullanılacak bir negatif kontrol organoidinin (sahte enjekte edilmiş) dahil edilmesi önemlidir. Bunu yapmak için, hücresiz 2 μL'lik bir nihai hacim elde etmek için seyreltilmiş çözünmüş bazal membran matrisi (3 mg / mL) ile daha önce tarif edildiği gibi bir organoid enjekte edin.