Mikrokuyu Dizilerinde Bakteri Kolonilerinin Fotobozunur Hidrojel Bazlı İzolasyonu

Özet

Kaynak: Fattahi, N., et al. Bakteri taraması, seçimi ve izolasyonu için fotobozunur hidrojel arayüzleri. J. Vis. Uzm. (2021)

Bu video, silikon mikrokuyu dizileri içindeki bakteri kolonilerini izole etmek için fotobozunur hidrojellerin kullanımını göstermektedir. Bakteri hücreleri önce mikro kuyulara yüklenir, çapraz bağlı bir hidrojel içinde kapsüllenir ve farklı koloniler halinde kültürlenir. Ultraviyole ışığa maruz kaldığında, hidrojelin hedeflenen bozunması, tek tek kolonilerin seçici olarak ekstraksiyonunu sağlar.

Protokol

1. Bakteri suşları ve kültür protokolleri

:

1. Uygun büyüme ortamı ile desteklenmiş agar plakaları üzerinde bakteri kolonileri oluşturur. Bu raporda, Bacillus subtilis (suş 1A1135, Bacillus Genetik Stok Merkezi) ATGN (0.079 M KH₂PO₄, 0.015 M (NH₄)₂SO₄, 0.6 mM MgSO₄·7H₂O, 0.06 mM CaCl₂ · 2H₂O, 0.0071 mM MnSO₄ · H₂O, 0.125 M FeSO_{4 ·} 7H₂O, 28 mM glikoz, pH: 7 ± 0.2, 15 g/L agar) 100 μg/mL spektinomisin ve Escherichia coli (suş 25922, ATCC) ile takviye edilmiş agar plakaları, 100 μg/mL ampisilin ile desteklenmiş ATGN agar plakaları üzerinde.
   NOT: Bu malzemelerle hidrojel kapsülleme ve salımına ilişkin önceki raporlarda bunun yerine A. tumefaciens C58 hücreleri kullanılmıştır
2. ATGN agar plakalarından istenen kolonileri seçin ve gece boyunca kültürlere başlayın. Burada kullanılan E. coli ve B. subtilis suşları için, 37 ° C'de kültür, 215 rpm'de 24 saat boyunca ATGN sıvı ortamında çalkalanır. Hücre kültürlerini ileride kullanılana kadar -80 ° C'de% 50 gliserol içinde saklayın.
3. Steril aşılama döngüleri kullanarak gliserol stoklarından her iki suşun kolonilerini seçin ve ATGN sıvı ortamında 37 ° C ve 215 rpm'de 24 saat inkübe edin.

2. Hidrojel oluşumu için gerekli malzemenin hazırlanması

1. Fotobozunur poli (etilen glikol) -o-nitrobenzil diakrilat (PEG-o-NB-diakrilat) sentezi
   NOT: PEG-o-NB-diakrilatın kurum içi sentezi iyi tanımlanmış ve daha önce rapor edilmiştir. Alternatif olarak, sentez rutin olduğu için, bir kimyasal sentez tesisinden dış kaynak sağlanabilir.
2. Çapraz bağlama buffer
   1. Bakteri türü için seçilen ortamın tarifini alın ve 2x besin içeren ortamı hazırlayın. Ortama 100 mM'lik bir nihai konsantrasyona kadar fosfat, örneğin NaH₂PO₄ ekleyin. Ardından, 5 M NaOH (aq) kullanarak pH değerini 8'e ayarlayın.
   2. Tampon çözeltisini sterilize edin ve daha fazla kullanılana kadar -20 °C'de saklayın.
      NOT: Ortamda bulunan geçiş metallerini dışarıda bırakın, çünkü bu metaller tiyollerin disülfidlere oksidasyonunu katalize eder.
3. PEG-o-NB-diakrilat çözeltisi
   1. Alikot PEG-o-NB-diakrilat (3.400 Da moleküler ağırlıklı) tozunun her mg'ı için, 49 mM PEG-o-NB-diakrilat konsantrasyonuna (98 mM akrilat konsantrasyonu) ulaşmak için 3.08 μL ultra saf su ekleyin.
   2. Çözeltiyi iyice karışana kadar vorteksleyin ve bu çözeltiyi daha fazla kullanılana kadar -20 °C'de saklayın.
4. 4 kollu PEG-tiyol çözeltisi
   1. 4 kollu PEG-tiyol (10.000 Da moleküler ağırlık) hazırlığı için, 20 mM konsantrasyona (80 mM tiyol konsantrasyonu) ulaşmak için mg toz başına 4 μL ultra saf su ekleyin.
   2. Bu çözeltiyi iyice karışana kadar girdaplayın ve bu çözeltiyi daha fazla kullanılana kadar -20 °C'de saklayın.

5. Silikon mikrokuyu dizilerinin imalatı

1. Parilen kaplama: Silikon gofretleri parilen ile kaplamak için önceki araştırma makalelerinde açıklanan standart protokolü kullanın.
2. Mikrofabrikasyon: Mikrokuyu dizisini tasarlamak ve imal etmek için literatürde açıklanan protokolü izleyin (Şekil 1).
   NOT: Parilen kaplı silikon gofretler üzerinde mikrokuyu dizileri üretmek için standart fotolitografik teknikler uygulanmıştır.

7. Mikrokuyu dizileri üzerinde hidrojel oluşumu

1. Mikrokuyu dizilerinde bakteri tohumlama
   NOT: 700 μL 0.1 OD₆₀₀ (600 nm dalga boyunda optik yoğunluk) hücre süspansiyonları, mikrokuyu dizisi substratları üzerine tohumlandı ve hücreleri arka plandan çıkarmak için parilen kaldırma yöntemi uygulandı.
2. 12.5 μL pH 8 fosfat tamponlu salin ATGN ile 5.6 μL PEG-O-NB-diakrilat ekleyerek ve 6.9 μL dört kollu PEG tiyol çözeltisi ile karıştırarak hidrojel öncü çözeltisini hazırlayın.
3. Öncü çözeltinin 12.5 μL'sini reaktif olmayan, perfloroalkillenmiş bir cam slayt üzerine pipetleyin ve hücrelerle aşılanmış mikro kuyu dizisi substratının iki karşıt tarafına iki adet 38 μm çelik ara parça (Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirin.
4. Perfloroalkillenmiş cam slaytı öncü çözelti damlası ile ters çevirin ve damlacığı mikro kuyu substratının ortasına yerleştirin. Ardından, hidrojel oluşumu için oda sıcaklığında (RT) 25 dakika inkübe edin.
5. Cam slaytı mikro kuyu alt tabakasından yavaşça çıkarın. Hidrojel membranı, mikro kuyu substratına bağlı kalmalıdır.

Sonuçlar

Şekil 1: Mikrokuyu dizilerinin tasarımı ve imalatı. (A) Mikro kuyu dizilerini üretmek için standart mikrofabrikasyon teknikleri uygulandı. silikon gofretler. (B) Her bir substrat, 20 μm derinliğe ve 30 μm ar...

Malzemeler