Gram Negatif Bakterilerin İç ve Dış Zar Fraksiyonlarının Ayrılması

Özet

Kaynak: Cian, M. B. et. al., Acinetobacter baumannii için Teknik Ayarlamalarla Gram Negatif Bakteriler için Hücre Zarfının İç ve Dış Zar Fraksiyonlarına Ayrılması. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu video, sükroz gradyan ultrasantrifüjleme kullanılarak Gram negatif bakterilerin iç ve dış zar fraksiyonlarının ayrılmasını göstermektedir. Membran fraksiyonları, membrana özgü bileşenlerin hedefli analizi için saflaştırılır ve düşük sıcaklıklarda saklanır.

Protokol

1. Membran Ekstraksiyonu için Genel Reaktifler ve Ortam Hazırlığı

1. Bakteri üreme ortamı: 1 L et suyu ortamını iyice temizlenmiş ve otoklavlanmış 2 L'lik bir şişede hazırlayın ve sterilize edin.
2. Genel resüspansiyon tamponu (1 M tris (hidroksimetil) aminometan tamponu (Tris Tamponu) pH 7.5; 50 mL): 6.05 g Tris bazını 30 mL H₂O içinde çözün. 5 M HCl ile pH'ı 7.5'e ayarlayın. Son hacmi ultra saf H₂O ile 50 mL'ye ayarlayın.
3. İki değerlikli katyon şelasyon çözeltisinin ana stoğu (0.5 M etilendiamin tetraasetik asit, EDTA pH 8; 100 mL): 18.6 g disodyum etilen tetraasetat·2H₂O ila 80 mL H₂O ekleyin. Kuvvetlice karıştırın ve sodyum hidroksit (NaOH) ile pH'ı 8.0'a ayarlayın. Ultra saf H₂O.
   NOT: EDTA'nın disodyum tuzu, çözeltinin pH'ı NaOH ilavesiyle ~8.0'a ayarlanana kadar çözünmeyecektir.
4. Ozmotik tampon A (0.5 M sükroz, 10 mM Tris pH 7.5; 1 L): 171.15 g sükroz tartın ve 1 L'lik bir silindire aktarın. 10 mL 1 m tris pH 7.5 ekleyin. Ultra saf H₂O ile 1 L'lik son hacme ayarlayın 4 °C'de saklayın.
5. Lizozim (10 mg / mL; 5 mL): 50 mg (tavuk yumurtası akı) lizozim ağırlığında ve 5 mL ultra saf H₂O içinde çözülür. 4 ° C'de saklayın.
6. Seyreltilmiş iki değerlikli katyon şelasyon çözeltisi (1.5 mM EDTA; 500 mL): 497.5 mL ultra saf H₂O'ya 1.5 mL 0.5 M EDTA (Adım 1.3) ekleyin. 4 ° C'de saklayın.
7. Ozmotik tampon B (0.2 M sükroz, 10 mM Tris pH 7.5; 2 L): 136.8 g sükroz tartın ve 2 L'lik bir silindire aktarın. 20 mL 1 m tris pH 7.5 ekleyin. Ultra saf H 2 O ile son hacmi 2 L'yeayarlayın. 4 °C'de saklayın.
8. Nükleaz kofaktörü (1 M magnezyum klorür, MgCl₂; 10 mL): 2.03 g MgCl₂ 6H₂O'yu 8 mL ultra saf H₂O içinde çözün. Hacmi 10 mL'ye ayarlayın. Oda sıcaklığında saklayın.
9. RNaz ve DNaz enzimlerini içeren nükleaz çözeltisi kokteyli: Malzeme Tablosuna bakınız. -20 °C'de saklayın.
10. Proteaz inhibitörü kokteyli: Malzeme Tablosuna bakınız. 4 °C'de saklayın.
11. Düşük yoğunluklu izopiknik sükroz gradyan çözeltisi (% 20 w / v sükroz, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.5 Çözeltisi; 100 mL): 20 g sükroz tartın ve 200 mL'lik bir silindire aktarın. 100 μL 1 M Tris tampon pH 7.5 ve 200 μL 0.5 M EDTA pH 8 ekleyin. Son hacmi ultra saf H₂O ile 100 mL'ye ayarlayın. Oda sıcaklığında saklayın.
12. Orta yoğunluklu izopiknik sükroz gradyan çözeltisi (% 53 w / v sükroz, 1 mM EDTA, 1mM Tris pH 7.5 Çözeltisi; 100 mL): 53 g sükroz tartın ve 200 mL dereceli bir silindire aktarın. 100 μL 1 M Tris tampon pH 7.5 ve 200 μL 0.5 M EDTA pH 8 ekleyin. Son hacmi ultra saf H₂O ile 100 mL'ye ayarlayın. Oda sıcaklığında saklayın.
    NOT: Yüksek sakaroz yüzdesi nedeniyle doğruluğu sağlamak için bu çözeltiyi dereceli bir silindirde hazırlayın. Manyetik bir karıştırma çubuğu ekleyin ve sükroz çözelti içinde tamamen eriyene kadar karıştırın. Bu işlem birkaç saat sürebilir.
13. Yüksek yoğunluklu izopiknik sükroz gradyan çözeltisi (% 73 w / v sükroz, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.5 Çözeltisi; 100 mL): 73 g sükroz tartın ve 200 mL dereceli bir silindire aktarın. 100 μL 1 M Tris tampon pH 7.5 ve 200 μL 0.5 M EDTA pH 8 ekleyin. Son hacmi ultra saf H₂O ile 100 mL'ye ayarlayın. Oda sıcaklığında saklayın.
    NOT: Yüksek sakaroz yüzdesi nedeniyle doğruluğu sağlamak için bu çözeltiyi dereceli bir silindirde hazırlayın. Manyetik bir karıştırma çubuğu ekleyin ve sükroz tamamen eriyene kadar karıştırın. Bu işlem birkaç saat sürebilir.
14. İzole membran depolama tamponu (10 mM Tris Tampon pH 7.5; 1 L): 1 L'lik bir şişeye 1 mL 1 M Tris Tampon pH 7.5 ekleyin ve son hacmi ultra saf H₂O ile 1 L'ye ayarlayın.

2. Membran Ekstraksiyonu için Bakterilerin Hazırlanması Bakterileri

1. donmuş gliserol stoklarından taze agar plakalarına sürün. Koloniler geliştikten sonra plakaları 4 °C'de saklayın. Tek bir koloniyi et suyu ortamıyla dolu 5 mL'lik bir tüpe aşılayın ve bakterileri gece boyunca istediğiniz gibi kültürleyin.
2. Gece boyunca bakteri kültürünü 1 L tercih edilen et suyu ortamına geri seyreltin ve istenen optik yoğunluk elde edilene kadar bakterileri kültürleyin.
   NOT: Büyüme fenotiplerini baskılamaya eğilimli mutant genotipler için tek bir bakteri kolonisinin 1 L et suyu ortamına aşılanması önerilir, ancak bazı Gram-negatif bakteriler diğerlerinden daha yavaş büyür. Tek koloni aşılaması ile yeterli bir kültür yoğunluğu elde etmek mümkün değilse, bir gece boyunca kültürü 1 L besiyerine geri seyreltmek, büyümeyi senkronize etmek için bir stratejidir. Bakteriyel-membran bileşimi, kültürün büyüme fazına bağlı olarak değişir (logaritmik ve sabit faz). Zamanın bir fonksiyonu olarak bakteri kültürleri için optik yoğunluktaki değişimi ölçen büyüme eğrileri, kültür yoğunluğunu büyüme fazı ile ilişkilendirmek için tüm suşlarla gerçekleştirilmelidir.
3. Et suyu kültürlerini içeren şişeleri buzun üzerine koyun. 600 nm'de (OD₆₀₀) optik yoğunluğu okuyun ve 6.0 ile 8.0 x 10¹¹ bakteri kolonisi oluşturan birime (CFU) eşdeğer kültür hacmini hesaplayın. S. Typhimurium için bu, 0.6 - 0.8 arasındaki bir OD_600'de 1 L kültüre karşılık gelir, çünkü 1.0'lık bir OD600 kabaca 1.0x10⁹ CFU / mL'ye eşittir. Bu hacmi bir santrifüj tüpüne ekleyin ve kalan kültürlerin kullanılacakları zamana kadar buz üzerinde kalmasını sağlayın.
4. Bakterileri 4 °C'de 7.000-10.000 x g'da sabit açılı yüksek hızlı bir santrifüjde 10 dakika boyunca santrifüjleyerek peletleyin.
   NOT: Santrifüjleri önceden soğutun ve düşük bir sıcaklıkta tutun. Tüm prosedür boyunca numuneleri buz üzerinde tutun.
5. Süpernatanı dikkatlice boşaltın ve atın.
   NOT: Membran fraksiyonları hemen ekstrakte edilmeyecekse, pelet hızlı dondurulabilir ve/veya -80 °C'de saklanabilir. Bununla birlikte, özellikle enterobakteriyel olmayan türler için, hücrelerin toplandığı gün doğrudan plazmoliz ile devam edilmesi önerilir.

3. Dış Zarın Ayrışması ve Plazmoliz:

1. Daha önce -80 °C'de saklanmışlarsa, hücre peletlerini buz üzerinde çözün ve prosedürün geri kalanında numuneleri buz üzerinde tutun. Santrifüj tüpü içindeki her bir hücre peletini 12.5 mL tampon A'da yeniden süspanse edin. Hücrelerin süspansiyonuna manyetik bir karıştırma çubuğu ekleyin.
2. Her hücre resüsitasyonuna 180 μL 10 mg / mL lizozim (son konsantrasyon 144 μg / mL) ekleyin. Numuneleri 2 dakika karıştırarak buz üzerinde tutun.
3. Her hücre resüspansiyonuna 12,5 mL 1,5 mM EDTA çözeltisi ekleyin ve 7 dakika daha buz üzerinde karıştırmaya devam edin.
4. Süspansiyonu 50 mL'lik bir konik tüpe boşaltın ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 9.000-11.000 x g'da santrifüjleyin.
5. Süpernatanları biyolojik olarak tehlikeli bir atık kabına atın ve peletleri buz üzerinde tutun.
6. Hücre peletine 25 mL tampon B ekleyin.
7. 55 μL 1 M MgCl₂, 1 μL RNase/DNaz nükleaz reaktifi (homojenizasyondan önce plazmolize uğrayan bakterilerle ilişkili viskozite problemlerini önlemek için) ve 1 μL proteaz inhibitörü kokteyli ekleyin Hücre peletinin üzerine oturan tampon B'nin hacmine
8. peleti yeniden süspanse edin. Homojen bir çözelti gözlemleyene kadar kuvvetlice pipetleyin ve vorteksleyin.
   NOT: Bu protokolün Adım 4'üne geçmeden önce homojen bir çözeltiye sahip olmak çok önemlidir. Yeniden süspanse edilen hücreler, viskoz kek hamuru benzeri bir görünüme ve kıvama sahip olmalıdır.
9. Her numuneyi 15 saniye boyunca vorteksleyin. Süspansiyonları buz üzerinde tutun ve Adım 4'e geçin.

4. Basınçlı Homojenizasyon ve Lizis
NOT: Lizis için çeşitli yöntemler kullanılabilir. Sonikasyon, ısı oluşumu nedeniyle ideal değildir. Ozmotik lizis elde edilebilir, ancak genellikle verimsizdir. Bu nedenle, yüksek basınçlı lizis öneriyoruz. Yüksek basınçlı lizis, çeşitli aletler kullanılarak elde edilebilir. French Press veya Emusliflex gibi homojenizasyon makinelerini öneriyoruz. Yüksek ozmolar sükroz çözeltilerine tepkisi değişen birçok Gram negatif bakteri türü ile çalışıyoruz. Yüksek basınçlı homojenizasyon adımı verimliliği, tekrarlanabilirliği ve verimi artırır.

1. French Press hücresini 4 °C'de önceden soğutun veya homojenizatör makinesinden gelen metal bobini buz üzerine yerleştirin.
2. Numuneyi Fransız basınçlı hücreye veya homojenizatör-numune silindirine dökün ve hücreyi istenen homojenizasyon basıncının altına getirin (French Press kullanırken 10.000 psi veya homojenizatör kullanırken 20.000 psi yeterli olmalıdır).
3. French Press kullanıyorsanız basıncı korurken çıkış akış hızını saniyede yaklaşık bir düşüşe ayarlayın.
4. Numuneleri buz üzerinde tutarken hücre lizatını 50 mL konik tüplerde toplayın.
5. Tam bir lizis elde etmek için 4.2-4.4 adımlarını üç ila beş kez tekrarlayın, bu tipik olarak numunenin şeffaflığında kademeli bir artışla gösterilir.
   NOT: Numune odası, numuneler arasında Tampon B ile yıkanmalı ve dengelenmelidir.
6. Parçalanmış hücreleri buz üzerinde tutun.

5. Toplam Membran Fraksiyonlama:

1. Kalan bozulmamış hücre materyalini peletlemek için parçalanmış bakteri örneklerini 6.169 x g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin. (örneğin, parçalanmamış bakteri hücreleri).
2. Artık homojenize membranları içeren süpernatantın kalan kısmını ultrasantrifüjleme için bir polikarbonat şişeye dağıtın.
   DİKKAT: Gerekirse, hücre örnekleri tampon B ile seyreltilerek dengelenebilir.
3. Hücre lizatlarını 184.500 x g'da en az 1 saat, 4 ° C'de ultrasantrifüj edin. Bu adım, membranların kalitesini etkilemeden gece boyunca gerçekleştirilebilir.
4. Ultrasantrifüj tüpünde bulunan kalan süpernatanı atın ve membran peletlerini buz üzerinde tutun (Şekil 1).
5. Membran peletlerini bir cam-Dounce homojenizatör kullanarak düşük yoğunluklu izopiknik-sükroz gradyan çözeltisinin 1 mL'sinde yeniden süspanse edin. Numune homojenatını bir cam Pasteur pipeti kullanarak 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve buz üzerinde tutun.
   NOT: Yalnızca toplam membran bileşimi analizi isteniyorsa, 1 mL izole membran depolama tamponu yerine 1 mL düşük yoğunluklu izopiknik-sükroz gradyan çözeltisi kullanın. Adım 5.5, yalnızca toplam bakteri zarı numuneleri isteniyorsa izolasyonun son noktasıdır. Numuneleri daha fazla aşağı akış analizi gerekli olana kadar -20 °C'de saklayın.

6. Çift Membranları Ayırmak için Yoğunluk Gradyanlı Ultrasantrifüjleme

:

1. Sallanan bir kova rotoru ve ultrasantrifüj için belirtilen uygun sayıda 13 mL polipropilen veya ultra berrak üstü açık tüp toplayın.
2. Tüpü hafifçe eğik bir konumda tutun ve aşağıdaki sırayla daha yüksek yoğunluktan daha düşük yoğunluğa yavaşça sükroz çözeltileri ekleyerek sükroz gradyanını hazırlayın: 2 mL %73 w/v sükroz,1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.54 mL %53 w/v sükroz, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.5
   1. Sonraki, % 20 w / v sükroz çözeltisi içinde yeniden süspanse edilmiş toplam membran fraksiyonunu (1 mL) ekleyin (adım 5.5). Membran fraksiyonunu, altında bulunan sükroz çözeltisi ile karıştırmaktan kaçının. Bu katmanların her biri arasında bölümler görünür olmalıdır.
   2. Son olarak, tüpü düşük yoğunluklu izopiknik-sükroz gradyan çözeltisi (yaklaşık 6 mL) ile doldurun. Polipropilen ve ultra şeffaf üstü açık borular, tüp desteği için mümkün olduğunca dolu (tüp üstünden 2 veya 3 mm) doldurulmalıdır.
3. Acinetobacter baumannii 17978 için ayarlama
   1. Farklı bakteri örnekleriyle kullanım için ayarlanmış bir sakaroz gradyanını uyarlayın. A. baumannii için, aşağıdaki sükroz gradyanı, zarların daha tam bir şekilde ayrılmasını sağlamıştır (Şekil 2).2 mL %73 w/v sükroz, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.54 mL %45 w/v sükroz, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.5
   2. Daha sonra,% 20 w / v sükroz çözeltisinde yeniden süspanse edilmiş toplam membran fraksiyonunu (1 mL) ekleyin (adım 5.5). Membran fraksiyonunu, altında bulunan sükroz çözeltisi ile karıştırmaktan kaçının. Bu katmanların her biri arasında bölümler görünür olmalıdır.
   3. Son olarak, tüpü düşük yoğunluklu izopiknik-sükroz gradyan çözeltisi (yaklaşık 6 mL) ile doldurun. Polipropilen ve ultra şeffaf üstü açık borular, tüp desteği için mümkün olduğunca dolu (tüp üstünden 2 veya 3 mm) doldurulmalıdır.
4. Numuneleri gece boyunca 288.000 x g ve 4 °C'de sallanan kova rotoru kullanarak ultrasantrifüjleyin.
   NOT: Önceki adımlarda kullanılan hacimler için 16 saat ile 23 saat arasında santrifüjleme süreleri öneririz.
5. P1000 pipet ucunun ucunu noktadan yaklaşık 5 mm uzakta kesin. Pipeti kullanarak üst kahverengi iç zar (IM) tabakasını çıkarın. IM fraksiyonunu ultrasantrifüjleme için polikarbonat bir şişeye aktarın.
6. Alt beyaz dış zarın (OM) IM fraksiyonu ile çapraz kontamine olmamasını sağlamak için yaklaşık 2 mL sükroz çözeltisini% 53-73 arayüzünün üzerinde bırakın. OM fraksiyonu için adım 6.4'ten itibaren pipetleme prosedürünü tekrarlayın (Şekil 1).
   NOT: Membranlar, alttaki santrifüj tüplerinin bir iğne ile delinmesi ve damla damla fraksiyonlar halinde toplanmasıyla da toplanabilir.
7. Ultrasantrifüj tüpünün kalan boşluğunu izole membran depolama tamponu ile doldurun ve ters çevirme veya pipetleme ile karıştırın. Numuneleri buz üzerinde tutun.
8. Şimdi yıkanmış ve izole edilmiş membranları 4 ° C'de 1 saat boyunca 184.500 x g'da ultrasantrifüjleme ile toplayın.
9. Süpernatanı atın ve Dounce homojenizasyonu ile membranları yeniden süspanse edin. 500-1000 μL depolama tamponu ekleyin. Numuneleri 2 mL mikrosantrifüj tüplerinde toplayın.
10. Bakteri zarı örneklerini -20 °C'de saklayın.

Sonuçlar

Şekil 1: Bu yöntemler makalesinde açıklanan Gram-negatif bakteri zarı izolasyon prosedürünü gösteren bir şema. Bakteri hücrelerini toplamak ve toplam, iç (IM) ve dış zarları (OM) izole etmek için kullanılan prosedür gösterilmiştir. Yaklaşım, IM çift tabak...

Malzemeler