Transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak siyanobakteriyel hücre dışı veziküllerin görselleştirilmesi

Özet

Kaynak: Biller, S. J., et al. Siyanobakteriyel hücre dışı veziküllerin izolasyonu ve karakterizasyonu. J. Vis. Uzm. (2022)

Bu video, yapısal ve karşılaştırmalı analizler için vezikül morfolojisinin, boyutunun ve saflığının yüksek çözünürlüklü görselleştirilmesini sağlayan, negatif boyama ile transmisyon elektron mikroskobu için siyanobakteriyel hücre dışı veziküllerin hazırlanmasını göstermektedir.

Protokol

1. İzole edilmiş veziküllerin karakterizasyonu

1. Negatif leke transmisyon elektron mikroskobu yapın (Malzeme Tablosuna bakınız) (TEM - transmisyon elektron mikroskobu; partikül boyutu, yapısı, saflığı).
   1. Görüntü kalitesini iyileştirmek için, üreticinin yönergelerine göre bir kızdırma deşarj sistemi kullanarak eski kaplanmış bir TEM ızgarasının yüzeyini kızdırma deşarjı yapın (bkz.
   2. Vezikül örneğinin ~ 5 μL'sini dikkatlice uygulayın ve 5 dakika bekletin.
      >NOT: Vezikül konsantrasyonları >10^{9 mL-1} olan numuneler tipik olarak en iyi sonuçları verecektir; daha seyreltik numunelerde görüntü başına az sayıda vezikül bulunur.
   3. Bir ızgaranın kenarını bir parça temiz filtre kağıdına dokundurarak numuneyi çıkarın.
   4. 20-50 μL'lik bir damla %2 uranil asetat (Malzeme Tablosuna bakınız) plastik filmle kaplı düz bir yüzeye pipetleyin ve ızgarayı 2 dakika boyunca üzerine yüzer şekilde yerleştirin.
   5. Filtre kağıdı kullanarak uranil asetatı çıkarın ve yıkamak için bir damla ultra saf su üzerinde kısa bir süre yüzdürün. Su ile yıkamayı ikinci kez tekrarlayın.
      NOT: Son kuru ızgara, adım 1.1.5'ten sonra görselleştirme için hazırdır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
2% Uranil asetat çözeltisi	Elektron Mikroskobu Bilimleri	22400-2	Negatif boyama - TEM
Karbon Destek Filmi 200 Mesh, bakır. CF200-Cu	Elektron Mikroskobu Bilimleri	71150	Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ızgara
kolayGlow kızdırma deşarj temizleme sistemi	Ted Pella	91000	Ticari TEM ızgara kızdırma deşarjı
Milli-Q Referans Su Arıtma Sistemi	Merck	Z00QSV0WW	Tip I ultra saf dereceli su elde etmek için su arıtma sistemi
Transmisyon elektron mikroskobu	JEOL	JEM-1400	Veya benzeri mikroskop