1. Polifosfat Ekstraksiyonu için Numunelerin Toplanması
- PoliP içeriğini belirlemek için ilgili koşullar altında bakteri yetiştirin. Bu protokol için, Lactobacillus reuteri'yi sistein içermeyen malik enzim indüksiyonu (MEI-C) ortamında çalkalamadan gece boyunca 37 ° C'de büyütün.
- 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde santrifüjleme ile toplam 50 – 100 μg hücresel proteine kadar yeterli hücreyi toplayın (aşağıdaki 3. adıma bakın). E. coli için bu, 0.2 - 0.4 arasında bir A600'de 1 mL'lik bir log faz kültürüdür. L. reuteri için bu, bir gecede 1 mL kültürdür. İlgilenilen diğer türler için gerektiği gibi ayarlayın.
- Süpernatanı hücre peletlerinden tamamen çıkarın.
- Hücre peletlerini 250 μL GITC lizis tamponunda (4 M guanidin izotiyosiyanat, 50 mM Tris-HCl, pH 7) yeniden süspanse edin ve 95 ° C'de 10 dakika inkübe ederek parçalayın. Lizatları -80 ° C'de saklayın.
NOT: Yüksek sıcaklıkta uzun süreli inkübasyon, poliP'nin hidroliz yoluyla bozulmasına neden olabileceğinden, lizis süresi ile tutarlı olun. Lizatlar -80 °C'de süresiz olarak saklanabilir.
DİKKAT: Guanidin izotiyosiyanat kaotropik bir tuzdur ve eldivenlerle kullanılmalı ve tehlikeli atık olarak atılmalıdır.
2. Hücre Lizatlarının Protein İçeriğinin Ölçülmesi
- GITC lizis tamponunda 0, 0.1, 0.2 ve 0.4 mg mL-1 BSA içeren sığır serum albümini (BSA) standartlarını hazırlayın.
NOT: GITC, Bradford testinin renk gelişimini etkilediğinden, BSA standartlarının GITC'de yapılması önemlidir. BSA standartları -20 °C'de süresiz olarak saklanabilir. - 5 μL çözülmüş, iyi karıştırılmış hücre lizatları ve 96 oyuklu berrak bir plakada kuyucukları ayırmak için BSA standartları.
- Her oyuğa 195 μL Bradford reaktifi ekleyin ve bir plaka okuyucuda 595 nm'de (A595) absorbansı ölçün (bkz. Malzeme Tablosu).
- y = mx + b formülünü kullanarak BSA standart eğrisi ile karşılaştırılarak her bir oyuktaki protein miktarını hesaplayın, burada y A595'tir, x BSA'nın μg'sidir, m standart eğrinin eğimidir ve b standart eğrinin y-kesişimidir. Her numunedeki toplam mg proteini belirlemek için elde edilen değeri 0.05 ile çarpın.
3. Polifosfatın Çıkarılması
:
- Her GITC ile parçalanmış numuneye 250 μL% 95 etanol ekleyin ve karıştırmak için girdap yapın.
- Bu karışımı bir silika membran döndürme kolonuna uygulayın ve 16.100 x g'da 30 saniye santrifüjleyin.
- Akışı atın, ardından 750 μL 5 mM Tris-HCl (pH 7.5), 50 mM NaCl, 5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA)%50 etanol ekleyin ve 16.100 x g'da 30 saniye santrifüjleyin.
- Akışı atın ve 2 x g'da 16,100 dakika santrifüjleyin.
- Kolonu temiz bir 1.5 mL mikrofüj tüpüne yerleştirin ve 150 μL 50 mM Tris-HCl (pH 8) ekleyin.
- Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin, ardından 8.000 x g.NOT: İstenirse, elüatlar -20 °C'de en az 1 hafta saklanabilir.
4. Sindirim Polifosfatı
- 50 mM Tris-HCl'de (pH 8) 0, 5, 50 veya 200 μM potasyum fosfat içeren standartlar hazırlayın.
NOT: Potasyum fosfat standartları oda sıcaklığında süresiz olarak saklanabilir. - Her fosfat standardının 100 μL'sini ve ekstrakte edilmiş poliP numunelerini 96 oyuklu şeffaf bir plakanın ayrı kuyucuklarına alıkoyun.
- (Örnek başına): 30 μL 5x ScPPX reaksiyon tamponu (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 250 mM amonyum asetat, pH 7.5)13, 19 μL H2O ve 1 μL saflaştırılmış ScPPX (1 mg mL-1) içeren bir ana karışım hazırlayın.
- 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 50 μL ana karışım ekleyin. 37 °C'de 15 dakika inkübe edin.
NOT: İstenirse, sindirilmiş poliP numuneleri -20 °C'de süresiz olarak saklanabilir.
5. Serbest Fosfatın Tespiti
- 0.185 g antimon potasyum tartaratı 200 mL su içinde çözerek, 150 mL 4 N H2S04 ekleyerek, ardından 1.49 g amonyum heptamolibdat ekleyerek tespit çözeltisi bazını hazırlayın. Çözünmesi için karıştırın ve ardından 456 mL'lik son hacme getirin. Partikülleri gidermek için solüsyonu filtreleyin ve 1 aya kadar 4 °C'de ışıktan korunarak saklayın.
- 1 M askorbik asitten oluşan bir stok çözeltisi hazırlayın. 4 °C'de 1 aya kadar ışıktan koruyarak saklayın.
- 9.12 mL algılama çözeltisi bazını 0.88 mL 1 M askorbik asit ile karıştırarak her gün yeni bir çalışma tespit çözeltisi stoğu hazırlayın. Kullanmadan önce algılama solüsyonunun oda sıcaklığına gelmesine izin verin.
- Her numuneye 50 μL algılama çözeltisi ekleyin ve 96 oyuklu plakada standart hale getirin ve renk gelişimine izin vermek için oda sıcaklığında yaklaşık 2 dakika inkübe edin.
- Bir plaka okuyucu ile 882 nm'de absorbansı ölçün ve potasyum fosfat standart eğrisiyle karşılaştırarak her numunenin fosfat konsantrasyonunu hesaplayın.
DİKKAT: Tespit çözeltisi toksik tuzlar ve güçlü asitler içerir. Eldiven giyin ve fazla çözeltiyi toksik atık olarak değerlendirin.
6. Hücresel Polifosfat İçeriğinin Hesaplanması
Adım
- 5.5'te belirlenen fosfat konsantrasyonlarını, aşağıdaki formüle göre her bir hücre lizatında poliP türevi fosfatın nanomollerine dönüştürün:
nmol poliP = 1.5 x (μM fosfat / 10)
NOT: Adım 5'teki standart eğri tabanlı yöntem, adım 4.2'de alıntılanan her 100 μL poliP numunesindeki fosfat konsantrasyonunu (μM cinsinden) belirler. Bu konsantrasyonu bir nmol sayısına dönüştürmek için, 100 μL, L cinsinden bir hacim vermek için 106'ya bölünür, konsantrasyon (μmol L-1) ile çarpılır, ardından 1.000 ile çarpılır (bir μmol'deki nmol sayısı). Bu, konsantrasyonun 10'a bölünmesine neden olur. 3. adımda hazırlanan toplam ekstrakt hacmi 150 μL'dir, bu nedenle tüm ekstraktta bulunan fosfatın nmolünü hesaplamak için elde edilen değeri 1.5 ile çarpmak gerekir. - Adım 1.4'te belirlenen her numunede nmol poliP'yi mg toplam proteine bölerek hücresel poliP içeriğini toplam hücresel proteine normalleştirin. PoliP seviyeleri, tek tek poliP'den türetilmiş serbest fosfatın konsantrasyonu cinsinden ifade edilir.
NOT: Bazı durumlarda, bir numunede bulunan poliP'den türetilmiş fosfat miktarı, fosfat standart eğrisinin doğrusal aralığının dışına düşebilir. PoliP seviyeleri çok yüksekse, adım 3.6'daki fazla poliP içeren elüat, gerektiği gibi 1:10 veya 1:100 oranında seyreltilebilir ve daha sonra adım 4 ila 6'da açıklandığı gibi tekrar ölçülebilir.
