Bu video, bakteri replikasyonu üzerindeki etkilerini incelemek için makrofajların Legionella pneumophila dış zar vezikülleri (OMV'ler) ile ön tedavisini göstermektedir. OMV'ler, konakçı bağışıklık sinyalini değiştirerek makrofajları enfeksiyona karşı daha izin verici hale getirir. Tedavi edilen hücrelerde tedavi edilmeyen hücrelere kıyasla daha yüksek koloni sayıları, OMV'lerin makrofajlar içinde L. pneumophila replikasyonunu desteklediğini gösterir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Dış Membran Vezikülleri ile Ön İşlem Görmüş Makrofajlarda Legionella pneumophila Replikasyonunun Test Edilmesi
514 görüntüleme
⸱
29 Ağustos 2025
Bu makalede
Özet
Protokol
1. Ön tedavi Makrofajları
- THP-1 (Tohoku Hastanesi Pediatri-1 hücreleri, bir insan monositik lösemi hücre hattı) hücrelerini hazırlayın.
NOT: THP-1, bir lösemi hastasından türetilen monositik bir hücre hattıdır.- 24 kuyucuk başına 2x105 THP-1 hücresi ekleyin ve makrofaj benzeri hücrelere 20 nM forbol 12-miristat 13-asetat (PMA) ekleyerek bunları farklılaştırın. 37 °C'de 24 saat inkübe edin.
- Ortamı 500 μL taze ortamla değiştirin ve 24 saat daha inkübe edin; THP-1 hücreleri için en uygun ortam,% 10 fetal buzağı serumu ile desteklenmiş Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) 1640 yüksek glikozu içerir.
- Murin kemik iliği kaynaklı makrofajları (mBMDM) izole edin.
- THP-1'den türetilmiş makrofajları veya mBMDM'yi dış zar vezikülleri (OMV'ler) ile tedavi edin.
- OMV'leri çözün ve protein miktarlarına (0.1, 1 ve 10 μg/mL) göre insan veya murin makrofajlarına ekleyin. Makrofajları OMV'lerle 37 ° C'de en az 20 saat inkübe edin.
2. Makrofajları Enfekte Edin ve Koloni Oluşturan Birim (CFU) Testi ile Bakteriyel Replikasyonu Değerlendirin
- Legionella pneumophila, ön işlem görmüş THP-1 hücreleri veya adım 4.3'ten mBMDM kullanın ve kontrol olarak önceden işlem görmüş makrofajları kullanın (2x105/24 kuyucuk). Ortamı değiştirmeyin.
- THP-1 hücrelerini L. pneumophila Corby WT ve mBMDM ile L. pneumophila Corby'nin flagelin içermeyen bir mutantı ile enfekte edin (her ikisi de 0.5'lik bir enfeksiyon çokluğu (MOI); 1x105 L. pneumophila / 24 kuyucuk) ve sırasıyla 24 ve 48 saat inkübe edin.
- Saponin ilavesiyle hücreleri kendi ortamlarında parçalayın (nihai konsantrasyon:% 0.1) ve 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
- Bakterileri pipetleme ile yeniden süspanse edin ve süspansiyonu bir reaksiyon kabına aktarın. L. pneumophila içeren ortamın steril fosfat tamponlu salin (PBS) içinde seri seyreltmelerini hazırlayın.
- Tamponlu kömür mayası özütü (BCYE) agar plakalarına 50 μL gerekli seyreltmeleri sürün ve 37 °C'de 3 gün inkübe edin.
- Oluşan kolonileri görsel olarak sayın. CFU
CFU sayım sonucunu, 0'e ayarlanan, önceden tedavi edilmemiş ancak enfekte makrofajlara normalleştirin.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 10 cm petridish | Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Almanya) | 82.1473 | |
| Aktif karbon | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Almanya) | X865.2 | |
| Agar-agar, Kobe I | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Almanya) | 5210.2 | |
| % 5 koyun kanı içeren Columbia agar | Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Almanya) | 254005 | |
| Ferric nitrat nonahidrat | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Almanya) | 5632.1 | |
| Fetal buzağı serumu (FCS) | Life Technologies GmbH (Darmstadt, Almanya) | 10270-106 | |
| Heracell 240i Karbondioksit inkübatörü | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Almanya) | 40830469 | |
| Heraeus Multifuge X3R | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Almanya) | 75004515 | |
| Aşılama döngüsü | Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Almanya) | 86.1567.010 | |
| L. pneumophila Corby | --- | --- | Prof Dr Antje Flieger (RKI, Berlin, Almanya) |
| L. pneumophila Corby ΔflaA | --- | --- | Prof Dr Klaus Heuner (RKI, Berlin, Almanya) |
| sağlanmıştırmBMDM | --- | Prof Dr Markus Schnare (Philipps University Marburg, Marburg, Almanya) ve Prof Dr Carsten Kirschning (Duisburg Essen Üniversitesi, Essen, Almanya) tarafından sağlanmıştırPBS | |
| Biochrom GmbH (Berlin, Almanya) | L 1825 | ||
| Phorbol 12-miristate 13-asetat | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Almanya) | P8139-1MG | |
| Döner çalkalayıcı (MaxQ 6000) | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Almanya) | SHKE6000 | |
| RPMI 1640 yüksek glikozlu | Life Technologies GmbH (Darmstadt, Almanya) | 11875-093 | |
| Saponin | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Almanya) | 9622.1 | |
| Ultrospec 10 | Biochrom Ltd (Cambridge, İngiltere) | 80-2116-30 | |
| THP-1 | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Almanya) | 88081201-1VL | |
| Sorvall Discovery 100 SE | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Almanya) | ||
| Maya özütü | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Almanya) | 2363.2 |
