Bakteri toplama ve mekanik parçalanma için bir prosedür

Özet

Kaynak: Mercier, N., et al. Gram-Pozitif Bakterilerde RNA Dizilimi ile Birleştirilmiş MS2-Afinite Saflaştırması. J. Vis. Exp. (2021)

Bu video, bakteri hücrelerinin toplanması ve hücre içi içerikleri serbest bırakmak için mekanik olarak parçalanması için adım adım bir prosedürü göstermektedir.

Protokol

1. Bakteri toplama

DİKKAT: Bu adım, patojenik bakterilerin işlenmesini içerir.

1. Eritromisin (10 μg/μL) ile takviye edilmiş 3 mL Beyin Kalp İnfüzyonu (BHI) ortamında pCN51-P3-MS2-sRNA veya pCN51-P3-MS2 plazmitlerini taşıyan bir suş kolonisi büyütün.
2. Her gece kültürünü, 0.05'lik bir OD_600nm'ye ulaşmak için eritromisin (10 μg / μL) ile takviye edilmiş 50 mL (≈1/100) taze BHI ortamında seyreltin. 250 mL sterilize şişeler kullanın (5:1 şişe-orta oran).
   NOT: Orta ve büyüme koşulları, incelenen sRNA'nın ekspresyon modeline göre ayarlanmalıdır.
3. Kültürleri 37 ° C'de 180 rpm'de 6 saat çalkalayarak büyütün.
4. Her kültürü 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
5. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 2.900 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
6. Peletleri buz üzerinde tutun ve doğrudan mekanik hücre lizisi gerçekleştirin veya peletleri -80 °C'de dondurun ve saklayın.

2. Mekanik hücre lizisi

DİKKAT: Buz üzerinde aşağıdaki adımlar uygulanmalı ve tamponlar 4 °C'de olmalıdır. Eldivenleri kullanın ve numuneleri RNazlardan korumak için tüm önlemleri alın.

1. Peletleri (adım 1.6) 5 mL Tampon A'da (150 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM MgCl₂ ve 1 mM DTT) yeniden askıya alın
.
2. Yeniden süspanse edilmiş hücreleri 3,5 g silika boncuk (0,1 mm) ile 15 mL santrifüj tüplerine aktarın.
3. Tüpleri mekanik bir hücre parçalama aletine yerleştirin. 40 m/s'de 4.0 sn'lik bir döngü çalıştırın.
   NOT: Hücreleri kırmak için bir döngü yeterli değilse, numuneleri buz üzerinde tutarken cihazı 5 dakika soğumaya bırakın. Ardından, 4,0 m/s'de 40 s'lik başka bir döngüyü tekrarlayın. Hücre lizizinin verimliliği, süpernatantın BHI-agar plakası üzerine kaplanmasıyla test edilebilir.
4. 15.700 x g'da 15 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı geri kazanın ve buz üzerinde tutun.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
15 mL santrifüj tüpleri	Falcon	352070
50 mL santrifüj tüpleri	Falcon	352051
250 mL kültür şişesi	Dominique Dutscher	2515074	Bakteri kültürleri
BHI (Beyin Kalp İnfüzyonu) Et Suyu	Sigma-Aldrich	53286	Büyüme ortamı
Eritromisin (eri)	Sigma-Aldrich	Fluka 45673	Büyüme ortamı
Lizsing Matris B Toplu	MP Biyomedikal	6540-428	Mekanik lizis
RNAPro Çözeltisi	MP Biyomedikal	6055050	Mekanik lizis
FastPrep cihazı	MP Biyomedikal	116004500	Mekanik lizis
Spektrofotometresi Genesys 20	ThermoFisher Scientific	11972278	Bakteri kültürleri