Küçük Düzenleyici RNA'ya Bağlı Bakteriyel Hedef RNA'nın Afinite Saflaştırması Kullanılarak İzolasyonu

Özet

Kaynak: Mercier, N., et al., Gram-Pozitif Bakterilerde RNA Dizilimi ile Birleştirilmiş MS2-Afinite Saflaştırması. J. Vis. Uzm. (2021)

Bu video, amiloz reçinesi üzerinde hareketsiz hale getirilmiş bir maltoz bağlayıcı protein (MBP)-MS2 kaplama protein füzyonu ile afinite saflaştırması kullanılarak bakteriyel hedef RNA'sına bağlanan MS2 etiketli küçük düzenleyici RNA'nın (sRNA) izolasyonunu göstermektedir.

Protokol

Tamponlar ve ortamlar

MAPS deneyleri için aşağıdaki tamponları ve ortamları hazırlayın: - Tampon A (150 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM MgCl₂ ve 1 mM DTT)- Tampon E (250 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 12 mM maltoz, %0.1 Triton, 1 mM MgCl₂ ve 1 mM DTT)

Kolon hazırlığı

DİKKAT: Amiloz reçinesinin kurumasına izin vermemeye dikkat edin. Gerekirse, sütunu bir uç kapakla kapatın. Afinite saflaştırmasına başlamadan önce tüm çözeltileri hazırlayın.

1. Bir kolon rafına bir kromatografi sütunu yerleştirin.
2. Kolon ucunu çıkarın ve kolonu ultra saf suyla yıkayın.
3. 300 μL amiloz reçinesi ekleyin.
4. Kolonu 10 mL Tampon A ile yıkayın.
5. 1.200 pmol MBP (Maltoz bağlayıcı protein)-MS2 proteinini 6 mL Tampon A içinde seyreltin ve kolona yükleyin.
6. Kolonu 10 mL Tampon A ile yıkayın.

MS2-afinite saflaştırması (Şekil 1)

1. Hücre lizatını kolona yükleyin.
   NOT: Toplam RNA'yı çıkarmak ve Northern blot ve transkriptomik analiz yapmak için 1 mL hücre lizatı (Ham ekstrakt, CE) tutun.
2. Akış fraksiyonunu (FT) temiz bir toplama tüpünde toplayın.
3. Kolonu 10 mL Tampon A ile 3 kez yıkayın. Yıkama fraksiyonunu (W) toplayın.
4. Kolonu 1 mL Tampon E ile yükseltin ve elüsyon fraksiyonunu (E) 2 mL'lik bir mikrotüpte toplayın.
5. Toplanan tüm fraksiyonları RNA ekstraksiyonuna kadar buz üzerinde tutun veya daha sonra kullanmak üzere -20 °C'de dondurun.

Sonuçlar

Şekil 1. Staphylococcus aureus'a uyarlanmış MAPS protokolünün şematik gösterimi. Plazmid yapımından veri analizine.

Malzemeler