$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Bakteri Suşlarının veya Mutant Kütüphanelerinin Hazırlanması
1. Uygun agar plakalarında test edilecek suşları çizgiden çıkarın. Bunlar deney için stok plakalarıdır.
1. Tek koloniler elde etmek için plakaları gece boyunca istenen sıcaklıkta inkübe edin. Bu deney için, 37 ° C'de Luria suyu (LB) agar üzerinde K. pneumoniae (NTUH-K2044 ve ATCC43816 suşları) ve 37 ° C'de nemlendirilmiş bir mum kavanozunda kan agar üzerinde S. pneumoniae (23F vahşi tip ve 23F Δcps)
kültürü.
2. Steril bir halka veya kokteyl çubuğu kullanarak 10 mL uygun et suyunu aşılamak için bir stok plakasından (adım 1.1) tek bir koloni seçin. Rastgele mutant kütüphanelerin taranması için, suyu 10 μL rastgele mutant kütüphane stoğu (TraDIS Kütüphanesi) ile aşılayın.
1. K. pneumoniae suşlarını düşük tuzlu LB ortamında 37 °C'de çalkalanarak ve S. pneumoniae suşlarını beyin kalp infüzyonu (BHI) ortamında statik olarak 37 °C'de inkübe edin.
2. Gece kültürünü 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 15 mL tüp ekleri ve aerosol geçirmez kapakları olan açılır kovalarda 3.200 x g'da 10 dakika boyunca tezgah üstü bir santrifüjde santrifüjleyin.
3. Süpernatanı atın ve peleti 2 mL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yeniden süspanse edin.
NOT: Süpernatanı laboratuvarda uygun sıvı biyolojik atık yolu ile atın. Santrifüjleme ve yeniden süspansiyon adımlarının (1.2.2 ve 1.2.3) amacı, gradyan üzerinde kolay görselleştirme için bakterileri konsantre etmektir. Tercih edilirse bakteri kültürleri doğrudan gradyan üzerine yüklenebilir. Ağır kapsüllü suşlar sıkı bir pelet oluşturmayabilir. Bu meydana gelirse, herhangi bir bakteri hücresini çıkarmadan mümkün olduğunca fazla süpernatanı çıkarın, 5 mL'lik son hacme 1x PBS ekleyin ve peleti yeniden süspanse edin. Protokole adım 1.2.5 ile devam edin.
5. Tüpleri adım 1.2.2'de açıklandığı gibi santrifüjleyin.
6. Süpernatanı atın ve peleti 2 mL 1x PBS'de yeniden süspanse edin. Hücreler artık kullanıma hazırdır.
NOT: Bakteri hücresi süspansiyonunun yoğunluğu kritik değildir, ancak gradyanda görselleştirme için yeterli olması gerekir. Minimum OD600 (600 nm'de optik yoğunluk) 4 önerilir.