Süreksiz yoğunluk gradyanı kullanılarak bakterilerin kapsül miktarına göre ayrılması

Özet

Kaynak: Feltwell, T., et.al. süreksiz bir yoğunluk gradyanı kullanarak bakterileri kapsül miktarına göre ayırmak. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu video, kapsül miktarına göre bakteri suşlarını ayırmak için süreksiz bir yoğunluk gradyanının kullanımını göstermektedir. Bir transpozon mutant kütüphanesini gradyan boyunca santrifüjleyerek, farklı kapsül yoğunluklarına sahip bakteriler farklı katmanlara lokalize olur. Ayrılan fraksiyonlar daha sonra aşağı akış analizi için toplanabilir.

Protokol

1. Hazırlanan Hücrelerin Degradelere Eklenmesi ve Santrifüjleme ile Ayrılması

:

1. 600 μL hazırlanmış hücreleri tüpteki gradyanın üstüne çok yavaş ve arayüzü karıştırmadan ekleyin.
2. Tüpleri tüp adaptörlerine yerleştirin ve dengeli olduklarından emin olmak için birleşik adaptörleri ve tüpleri tartın.
   1. Tüp adaptörlerini tezgah üstü santrifüj içindeki sabit açılı bir rotora yerleştirin. 3.000 x g'da 30 dakika santrifüjleyin.
   2. Santrifüjlemeden sonra, tüpleri dikkatlice çıkarın, uygun bir rafa yerleştirin ve sonuçları bir kayıt olarak fotoğraflayın.
3. Üronik asit miktar tayini veya DNA ekstraksiyonu için bakteri fraksiyonlarını geri kazanın.
   1. Aşağı akış uygulamaları gerekmiyorsa, numuneleri/gradyanları laboratuvardaki uygun sıvı biyolojik atık yolu üzerinden atın.
      NOT: Yeni bakteri türleri/türleri için ayrımı doğrulamak önemlidir. Gradyandan elde edilen bireysel fraksiyonlar, her bir fraksiyonun kapsül fenotipini doğrulamak için mikroskopi, üronik asit tahlili veya başka bir uygun kantitatif tahlil ile incelenmelidir. Amaç, agregasyon veya hücre boyutuna göre ayırmaksa, bağımsız uygun tahliller kullanılmalıdır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
Rotor A-4-81 ve 500ml kovalı Santrifüj 5810R	Eppendorf	5810 718.007
15 ml tüpler için adaptörler	Eppendorf	5810 722.004
Sabit açılı rotor F-34-6-38	Eppendorf	5804 727.002
2.6 - 7 ml tüp adaptörü	Eppendorf	5804 739.000
Santrifüj 5424 Rotor dahil FA-45-24-11	Eppendorf	5424 000.460
5 ml polipropilen yuvarlak tabanlı boru	Falcon	352063