Gram-negatif bakterilerin mikroakışkan ayrılması için aptamer yardımlı akustoforez

Özet

Kaynak: Choi, H. J., et al. Aptamer Afinite Boncukları Kullanılarak Gram-Negatif Bakterilerin Akış Yoluyla Ayrılması için Mikroakışkan Akustoforez. J. Vis. Uzm. (2022)

Bu video, bir mikroakışkan çip içinde aptamer kaplı mikro boncuklar ve akustik kuvvetler kullanılarak Gram-negatif bakterileri karışık bir bakteri örneğinden seçici olarak ayırma yöntemini göstermektedir.

Protokol

1. Akustoforez kurulumu ve işletimi
   1. Polietereterketon (PEEK) tüplerini iki numune ve tampon enjekte etmek için iki girişe ve atıkları toplamak ve boşaltmak için iki çıkışa bağlayın (Şekil 1).
   2. Mikroakışkan akustoforez kanalını 10 mL'lik bir şırınga kullanarak kabarcıksız demineralize su ile manuel olarak doldurun.
   3. Sıvı akışını kontrol etmek için iki veya daha fazla çıkış kanalına sahip hassas bir basınç kontrolörü hazırlayın. Ardından, şişeleri kapaklarında iki delik olacak şekilde sırasıyla numune ve tampon ile yarıya kadar doldurun ve bunları çip girişine bağlayın.
      NOT: İki veya daha fazla çıkış kanalına sahip bir hassas basınç kontrol cihazı, birden fazla hassas basınç kontrol cihazı ile değiştirilebilir. Tampon girişinde, numune enjeksiyonu sırasında numunenin merkeze hareket etmesini önleyen laminer bir akış oluşturabilen bir tampon, bir akış kontrolörü aracılığıyla enjekte edilir.
   4. Cihazı hazırladıktan sonra, hassas basınç kontrol cihazını kullanarak numune girişine 2 kPa ve tampon girişine 4 kPa basınç uygulayarak numuneyi ve tamponu enjekte edin.
      NOT: Bu sırada, düzgün laminer akış için, tamponun enjeksiyon basıncı, numunenin enjeksiyon basıncından daha yüksek olmalıdır. Akış, giriş kanalına bağlı aspiratöre sabitlenmiş bir akış kontrolörü tarafından kontrol edilir.
   5. Mikroskopta kontrol ederken piezoelektrik dönüştürücüyü (PZT) kullanarak mikroakışkan kanalın merkezine hareket ettirmek için bir boncuğa odaklanın.
      NOT: Boncuk ne kadar büyükse, dalga formu üzerindeki etki o kadar büyük olur, bu nedenle düğüm noktasıyla hizalamak daha kolaydır. Amplifikatörlü bir fonksiyon üreteci, mikrokanalda bir sinüs dalgası oluşturmak için PZT'ye güç uygular. Mikrokanalın üst ve alt kısımları camdan yapıldığından, üretilen sinüs dalgası yansıtılır ve bir düğüm noktası oluşturur.
   6. Tek kanallı bir fonksiyon üreteci kullanarak, 3.66 MHz'lik bir rezonans frekansı üretin ve bir güç amplifikatörü kullanarak tipik bir sinyali 16 dB (yaklaşık dokuz kat) yükseltin (Şekil 1).
      NOT: Aktüatörün rezonans frekansı kanalın boyutuyla eşleşmelidir, çünkü kanal kare şeklindedir, PZT tek bir düğüm oluşturmak için doğru bir frekansta çalışır.
   7. Bir floresan mikroskobu ve 1.200 fps'de (saniyede kare sayısı) çalışan yüksek hızlı bir kamera ile akustoakışkan çip üzerindeki ayırma ve zenginleştirme işlemlerini gözlemleyin.
   8. Toplama ve atık çıkış numuneleri yoluyla boşaltılan bakteriye bağlı boncukların ve bakterilerin floresan mikroskop kamerası ile çekilen görüntüleri kontrol ederek Gram-negatif (GN) bakterilerin ve Gram-pozitif (GP) bakterilerin varlığını veya yokluğunu ölçün ve analiz edin.
      NOT: Tampon, bakteri ve aptamerli mikro boncuklar ana kanaldan geçer ve mikro boncuklar, PZT tarafından indüklenen çip içi akustoforez yoluyla merkezi olarak hizalanır. Son olarak, bağlı GN bakterisine sahip mikro boncuklar toplama çıkışında toplanır ve toplanmayan bakteriler atık çıkışından dışarı atılır.

Sonuçlar

Şekil 1: Hücreleri ayırmak ve toplamak için kullanılan akustoakışkan sistemin şeması. Numune veya tampon çözeltisi, akış kontrolörü aracılığıyla giriş portuna enjekte edilir. Boncuk merkezleme ve numune ayırma için, mikro kanalda akustik...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
10 μm Streptavidin kaplı mikro boncuklar	Bang Laboratories	CP01007	Aptamer afinite boncukları
Aptamer	Entegre DNA Teknolojileri	Bakteri konjugasyonu için	GN3-6'RNA
Escherichia coli DH5α	KCTC	KCTC2571	Hedef bakteri
Fonksiyonel jeneratör	GW Instek	AFG-2225	Frekans üret
Yüksek hızlı kamera	Photron	FASTCAM Mini	Ayrılma gözlemi
KOVAX-ŞIRINGA 10 mL Şırınga	Koreavaccine	22G-10ML	Mikroakışkan akustoforez kanalını kabarcıksız demineralize su ile doldurun.
Mikroskop	Olympus A.Ş.	IX-81	Ayrılma gözlemi
PEEK Tüpleri	Saint-Gobain Ppl Corp.	AAD04103	Parçacıkları enjekte edin veya toplayın
Piezoelektrik dönüştürücü	Fuji Seramik	C-213	Kanalda belirli dalga üretin
Güç amplifikatörü	Amplifikatör Araştırması	75A250A	Yükseltme frekansı
Basınç kontrolörü / μflucon	AMED	AMED-μflucon	Hava basıncı/akış kontrol cihazının kontrolü