Bakteriyel Biyolüminesansı Hücre Yoğunluğu ile İlişkilendirmek için İn Vivo Test

Özet

Kaynak: Brodl, E., et al. Biyolüminesan bakterilerin hücre yoğunluğu ve ışık emisyonunun yerinde ölçümü ve korelasyonu. J. Vis. Uzm. (2018).

Bu video, dönüştürülmüş bakterilerde biyolüminesansın hücre yoğunluğu ile ölçümünü ve korelasyonunu göstermektedir. Sıvı bir kültürü başlatmak için tek bir bakteri kolonisi kullanılır. Kültür, istenen hücre konsantrasyonunda bir kuyuya yerleştirilir. Bakteriyel biyolüminesans için gerekli geni ifade etmek için bir antibiyotik ve indükleyici eklenir. Absorbans ve biyolüminesans okumaları, bir plaka okuyucu kullanılarak düzenli aralıklarla alınır.

Protokol

1. Escherichia coli'de lux Operon'un Tasarımı, Hazırlanması ve İfadesi

Not: Bu bölümde kullanılan ticari kitler hakkında bilgi için Malzeme Tablosuna bakın.

1. Lux operonunu E. coli'ye aktarmak için, uygun kısıtlama bölgelerine ve ilgilenilen antibiyotik direnç genine sahip standart bir pET vektörü seçin (örneğin, pET28a; NcoI, XhoI, kanamisin).
2. Photobacterium mandapamensis 27561'in (GenBank: DQ988878.2) DNA dizisine dayalı olarak Gibson montajı için parçaları ve üst üste binen primerleri tasarlayın.
3. Şablon olarak Photobacterium mandapamensis 27561'in tasarlanan primerleri ve izole edilmiş genomik DNA'sı (deoksiribonükleik asit) ile standart bir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) reaksiyonu oluşturun.
   NOT: İlgili bakteri suşunun genomik DNA'sının izolasyonu PCR etkinliğini artırır.
4. PCR ürününü spin-kolon saflaştırması yoluyla saflaştırın.
5. İzole edilmiş pET28a vektörünün NcoI ve XhoI ile 37 ° C'de 45 dakika boyunca kısıtlama sindirimini gerçekleştirin.
6. Doğrusallaştırılmış vektörü ve PCR fragmanlarını agaroz jel elektroforezi ve müteakip spin-kolon saflaştırması yoluyla saflaştırın.
7. Her bir parçanın ve doğrusallaştırılmış vektörün DNA konsantrasyonunu belirleyin ve protokole göre montaj için en uygun miktarları hesaplayın.
   NOT: Montajın etkinliği, parça boyutuna ve sayısına bağlıdır ve üreticinin protokolüne göre ayarlanmalıdır.
8. Tüm parçaları ve tamponu bir PCR tüpünde birleştirdikten sonra, montaj karışımını bir PCR makinesinde 50 °C'de 1 saat inkübe edin.
9. Birleştirilmiş vektör ürününü, E. coli bakteriyel plazmit dönüşümü için standart dönüşüm protokollerine göre yüksek verimli plazmit replikasyonu için uygun bir E. coli sistemine dönüştürün (örneğin, E. coli TOP10 veya XL-1).
10. Dönüşüm plakasından kolonileri toplayın ve DNA izolasyonu için yeni plakalara çizin.
11. Plazmit DNA'yı standart protokollere göre izole edin.
12. Tüm fragmanlar dahil olmak üzere plazmidin doğru montajını doğrulamak için, önce monte edilen her fragman için özel primerler kullanarak standart protokollere göre bir koloni PCR gerçekleştirin.
13. Koloni PCR'sine ve müteakip agaroz jel elektroforezine ek olarak, doğru montajı ve doğru DNA dizilerini doğrulamak için tüm izole montaj vektörlerini DNA dizilimi için hazırlayın.
14. Doğrulanmış plazmiti, E. coli bakteriyel plazmit dönüşümü için standart dönüşüm protokollerine göre yüksek verimli protein üretimi için uygun bir E. coli sistemine dönüştürün (örneğin, E. coli BL21).
    NOT: Doğrudan aşağıdaki ifade protokolü ile devam edin. Daha uzun süre depolama için, bir gliserol stoğunun hazırlanması önerilir.

2. Modifiye E. coli SuşlarınınEkspresyonu

1. Uygun hacimde Luria-Bertani (LB) ortamının (örn., 100 mL) önceden hazırlanmış gliserol stoğu ile E. coli BL21 hücrelerinin monte edilmiş plazmid ile dönüştürülmüş veya doğrudan bir dönüşüm plakasından. 100 μL kanamisin (50 mg/mL; pET28a'nın antibiyotik direnç geni) ekleyin ve ONC'yi gece boyunca bir inkübatör çalkalayıcıda 37 °C ve 120 rpm'de inkübe edin.
2. Ana ekspresyon kültürünü (ör., 800 mL LB ortamı) 8 mL ONC ile aşılayın ve 800 μL kanamisin (50 mg / mL) ekleyin.
3. Ana kültürü 37 ° C ve 120 rpm'de bir inkübatör çalkalayıcıda, hücre yoğunluğu 0.6 - 0.8 (yaklaşık 2.5 saat) OD_600'e ulaşana kadar inkübe edin.
4. Kuluçka sıcaklığını 28 °C'ye düşürün.
5. 0.1 mM.NOT: Ampirik testler, sıcaklığın 28 ° C'ye düşürülmesinin en yüksek ışık yoğunluğunu verdiğini gösterdi.
6. Hücreleri parlamaya başlayana kadar gözlemleyin (yaklaşık 1 saat).
   NOT: İfadenin amacına bağlı olarak, hücreler ertesi güne kadar büyütülür ve daha sonra toplanır veya hücreler parladıkları sürece (en fazla 48 saat) sallanmaya devam edilebilir. Hücrelerin toplanması ve herhangi bir proteinin saflaştırılması standart prosedürlere göre yapılabilir.

3. Bakteriyel Biyolüminesan Suşların İfadesi

NOT: Bakteriyel biyolüminesan suşlar, büyüme ve ışık üretimi için özel bir büyüme ortamı/yapay deniz suyu ortamı gerektirir.

1. Ayrı ayrı hazırlanmış iki ortam bileşeninden oluşan yapay deniz suyu ortamı hazırlayın.
   NOT: Aşağıdaki miktarlar 1 L sıvı ortam veya 1 L agar ortamı içindir.
   1. Yapay deniz suyu ortamı için aşağıdaki tuzları tartın: 28.13 g NaCl (Sodyum klorür), 0.77 g KCl (Potasyum klorür), 1.60 g CaCl₂ · 2H_2O(Kalsiyum klorür dihidrat), 4.80 g MgCl₂ · 6H_2O(Magnezyum klorür hekzahidrat), 0.11 g NaHCO3 (Sodyum bikarbonat) ve 3.50 g MgSO₄ · 7H_2O(Magnezyum sülfat heptahidrat).
   2. 1 L damıtılmış su ekleyin ve tüm bileşenleri çözün.
   3. LB ortamı için aşağıdaki malzemeleri tartın: 10 g maya özütü, 10 g pepton ve agar plakaları için ek 20 g agar.
   4. 250 mL musluk suyu ekleyin ve bileşenleri çözün.
   5. Hazırlanan her iki ortamı ayrı ayrı 121 °C'de 20 dakika boyunca otoklavlayın.
   6. Agar plakaları için, otoklavlamadan hemen sonra 250 mL LB ortamını 750 mL yapay deniz suyu ortamı ile birleştirin ve plakaları hazırlayın.
   7. Sıvı ortam için, 250 mL LB ortamını otoklavlamadan hemen sonra veya soğutulduğunda 750 mL yapay deniz suyu ortamı ile birleştirin.
      NOT: Yapay deniz suyu ortamı, tuz çökeltmesi yoluyla bulanıklaşabilir.
2. Bakteriyel biyolüminesan suşları yapay deniz suyu ortamı agar plakaları üzerinde çizin ve gece boyunca 24 - 30 °C'de inkübe edin.
   NOT: Bakteri suşlarının uzun süre saklanması normalde bakteri kültürünün gliserol stoklarının dondurulmasıyla elde edilir. Çözülmeden sonra büyümedeki gecikme fazı nedeniyle, sıvı kültürler için kullanımdan önce, tüm suşlar için tek tip başlangıç koşulları sağlamak için suşlar her zaman önce agar plakaları üzerinde çizilmelidir.
3. Plakadan tek bir koloni ile 100 mL yapay deniz suyu ortamını aşılayarak bir ONC hazırlayın. ONC'yi gece boyunca bir inkübatör çalkalayıcıda 24 - 30 °C ve 120 rpm'de inkübe edin.
4. 800 mL yapay deniz suyu ortamını 8 mL ONC ile aşılayın.
5. Bakteri hücrelerini 24 - 30 °C ve 120 rpm'de bir inkübatör çalkalayıcıda inkübe edin.
   NOT: Biyolüminesan bakterilerin ışık yoğunluğu profili, sıcaklığa göre büyük ölçüde değişir. İlgili bakteri suşunun ışık üretiminin düzenleyici mekanizmalarına bağlı olarak, ışık emisyonu yaklaşık 1 - 6 saat sonra başlayabilir.
6. Bakteri hücre kültürlerini parlamaya başlayana kadar (yaklaşık 1 - 6 saat) gözlemleyin.
   NOT: İfadenin amacına bağlı olarak, hücreler ertesi güne kadar büyütülür ve daha sonra toplanır veya hücreler parladıkları sürece sallanmaya devam edilebilir. Hücrelerin toplanması ve herhangi bir proteinin saflaştırılması standart prosedürlere göre yapılabilir.

4. Bakteriyel Biyolüminesan Suşlar ve Modifiye E. coli Suşlarıiçin İn Vivo Aktivite Testi

NOT: Suşların uzun süre saklanması normalde bakteri kültürünün gliserol stoklarının dondurulmasıyla elde edilir. Çözülmeden sonra büyümedeki gecikme fazı nedeniyle, sıvı kültürler için kullanımdan önce, tüm suşlar için tek tip başlangıç koşulları sağlamak için suşlar her zaman önce agar plakaları üzerinde çizilmelidir.

1. İstenen biyolüminesan bakteri suşunu veya modifiye edilmiş E. coli suşunu bir agar plakası üzerine geçirin ve gece boyunca 28 °C'de inkübe edin.
   NOT: İnkübasyon sıcaklığı suştan suşa değişebilir ve ampirik olarak değerlendirilmelidir. Biyolüminesan bakteri suşları ile modifiye edilmiş E. coli suşlarını karşılaştırabilmek için büyüme koşullarının aynı olması gerekir.
2. Bir agar plakasından tek bir koloni ile ilgili suş ile 3 mL ortamı aşılayın ve hücreleri 28 ° C ve 180 rpm'de bir inkübatör çalkalayıcıda yaklaşık 1-2 saat inkübe edin.
3. 650 nm'de sıvı kültürün 1:10 seyreltmesinin hücre yoğunluğunu ölçün. 0.05.
   NOT: 0.05.br OD650 ile 1 mL kültür için oranı ve hacmi hesaplayın: Sonraki plaka okuyucu testi, suşların ışık emisyonunun girişimini önlemek için hücre yoğunluğunu 650 nm'de belirleyecektir.
4. Hesaplanan kültür ve ortam hacmini, cam tabanlı 24 oyuklu siyah duvarlı bir plakaya pipetleyin. Modifiye edilmiş E. coli suşu için, numunelere 1 μL kanamisin (pET28a vektörünün antibiyotik direnci) ve 1 μL IPTG (gen ekspresyonunun indüksiyonu) ekleyin. Ölçümler sırasında buharlaşmayı önlemek için plakanın üzerine bir kapak yerleştirin.
   NOT: Tüm lux operonunu içeren pET28a vektörünün E. coli kültürü tarafından kaybolmamasını sağlamak için, plaka kuyucuklarındaki her E. coli örneğine kanamisin eklenmelidir ve E. coli hücrelerinin ışık üretiminin ölçülebilmesini sağlamak için, gen ekspresyonu IPTG tarafından indüklenmelidir. Karışma ve ölçüm girişimini önlemek için, cam tabanlı ve şeffaf kapaklı siyah duvarlı kuyu plakaları en iyi sonuçları gösterdi. Bununla birlikte, karışma gözlemlenebilir ve iyi konumların dikkatli bir şekilde seçilmesi gerekir.
5. Ölçümü bir plaka okuyucuda başlatın.
   NOT: Plaka okuyucu protokolü, absorbans ve biyolüminesans olmak üzere iki ölçümü birleştiren bu test için özel olarak geliştirilmiş bir komut dosyasına dayanmaktadır. Veri noktaları, ölçümler arasında kalıcı çalkalama ve 28 °C'lik sabit bir sıcaklık ile her 10 dakikada bir toplanır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
NEBuilder Yüksek Kaliteli DNA Montaj Klonlama Kiti	New England Biolabs Inc.	10 rxndx.doi.org/10.17504/protocols.io.cwaxad	E2621S
	Thermo Scientific	F530S
Q5 Yüksek Sadakatli DNA Polimeraz	New England Biolabs Inc.	M0491S
GeneJet Genomik DNA Saflaştırma Kiti	Thermo Scientific	K0721	50 rxn
Kısıtlama enzimleri ve tampon için (NcoI, XhoI)	New England Biolabs Inc.	R3193S/R0146S
Sihirbaz SV Jel ve PCR Temizleme kiti	Promega	A9282	250 rxn
Monarch DNA Jel Ekstraksiyon Kiti	New England Biolabs Inc.	50 rxn için	#T1020S
GeneJet Plazmid Miniprep Kiti	250 rxn için	Thermo Scientific	K0503
GoTaq G2 DNA Polimeraz	Promega	M7841
Cam tabanlı 24 oyuklu siyah sensör plakası	Greiner Bio One	662892
FLUOStar Omega plaka okuyucu	BMG Labtech
OPTIMA/Mars Analizi Yazılım	BMG Labtech		Sürüm 2.20
Microsoft Excel 2010	Microsoft
Multitron Standart İnkübatör Çalkalayıcı	Infors AG

Phusion Polimeraz için