Magnetospirillum bakterilerinin yetiştirilmesi ve manyetotaktik davranışlarının değerlendirilmesi

Özet

Kaynak: Le Nagard, L., et al. Magnetospirillum cinsinin büyüyen manyetotaktik bakterileri: MSR-1, AMB-1 ve MS-1 suşları. J. Vis. Uzm. (2018).

Bu video, Magnetospirillum bakterilerinin hem sıvı hem de yarı katı ortamlar kullanılarak mikroaerobik koşullar altında nasıl kültürleneceğini göstermektedir. Oksik-anoksik arayüzde görünür bir bakteri bandının oluşumunu ve oksijen tükendikçe yukarı doğru göçünü vurgular. Video ayrıca, bir manyetik alana tepki olarak yönlü yüzmeyi gözlemleyerek manyetotaktik davranışın nasıl değerlendirileceğini de gösterir.

Protokol

1. Manyetotaktik bakterilerin aşılanması (MTB)

NOT: AMB-1, MS-1 ve MSR-1 suşlarının kültürleri ticari olarak elde edilebilir (Malzeme Tablosu).

DİKKAT: Aşağıdaki tüm adımları steril koşullarda, bir Bunsen brülörünün alevi altında gerçekleştirin.

1. MSR-1, AMB-1 ve MS-1 suşlarının sıvı ortamda aşılanması
   1. 125 mL'lik boş bir serum şişesini bir butil-kauçuk tıpa ve bir alüminyum kıvrımlı conta ile kapatın. Durdurucudan şişeye iki iğne yerleştirin ve bunlardan birine bir şırınga bağlayın. Şırıngayı, N₂ istasyonu için kullanılanla aynı tip boru ile O₂ silindirine bağlayın.
   2. Şişedeki tüm havanın O 2 ile değiştirildiğinden emin olmak için O_2'nin şişeden yaklaşık 30 dakika akmasına izin verin. Her iki iğneyi de çıkarın, şişede hafif bir aşırı basınç oluşmasına izin verin ve ardından otoklavlayın. Kullanmadan önce şişenin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.
      NOT: Zaman kazanmak için, ortam hazırlama sırasında Adım 1.1.1 ve 1.1.2'yi uygulayın ve şişeyi ortam veya stok çözeltileriyle birlikte otoklavlayın.
   3. Hem taze orta boy şişenin hem de O₂ şişesinin tıpalarının üst kısımlarını, üzerlerine birkaç damla %70 etanol çözeltisi uygulayarak ve bunları bir Bunsen brülörünün alevinden geçirerek sterilize edin.
   4. Steril bir şırınga ve bir iğne kullanarak, O₂ şişesinden 1 mL O₂ çıkarın ve taze orta boy şişeye aktarın. Şırıngada hava oluşmasını önlemek için bu adım sırasında iğnenin şırıngaya sıkıca oturduğundan emin olun.
   5. Bir cam şişede yetiştirilen başka bir kültürden elde edilen aşı kullanılıyorsa, hem taze orta boy şişenin hem de eski kültür şişesinin tıpalarını, üzerlerine birkaç damla %70 etanol çözeltisi uygulayarak ve bunları bir Bunsen brülörünün alevinden geçirerek sterilize edin. Aşılamayı bir donmuş kültür tüpünden kullanıyorsanız, tüp bir Bunsen brülörünün alevi altında kapatılmış olarak oda sıcaklığına ısınmasına izin verin.
   6. Bir cam şişede yetiştirilen başka bir kültürden gelen aşı kullanılıyorsa, eski kültürün 1 mL'sini taze ortama aşılayın. Aşıyı donmuş bir stoktan kullanıyorsanız, dondurma işleminde kullanılan gliserol veya dimetil sülfoksiti (DMSO) seyreltmek için sadece 0.1 mL aşılayın. Her iki durumda da steril bir iğne ve steril bir şırınga kullanın.
   7. Kültürü 32 ° C'de inkübe edin ve 4 ila 7 gün sonra taze ortama aşılayın.
2. MSR-1'in_O2 gradyanlı yarı katı bir ortamda aşılanması
   1. Taze ortam tüpünün, pembeden renksiz bir arayüzle gerçekleştirilen iyi tanımlanmış bir oksik-anoksik arayüz (OAI) gösterdiğini doğrulayın.
   2. Aşı başka bir O₂ konsantrasyon gradyanlı yarı katı kültürden geliyorsa, bakterilerin oluşturduğu bant üzerine yerleştirilen steril bir pipet ucu ile kültürün 50 μL'sini pipetleyerek bakterileri hasat edin. Bu bakterileri OAI'de taze ortamda (pembe / renksiz arayüz) yavaşça aşılayın ve arayüzü rahatsız etmekten kaçının. Aşı donmuş bir kültürden geliyorsa, bunun yerine 100 μL aşı ile aynı şekilde devam edin.
   3. Tüpü kapatın ve bakterilerin 25 °C ile 30 °C arasında büyümesine izin verin. Bakteri bandı ortamın yüzeyine ulaşmadan önce aynı prosedürü kullanarak taze ortama aktarın.

2. Bakterilerin Gözlemlenmesi

:

1. Kültür şişesinin tıpasını üzerine% 70 etanol çözeltisi uygulayarak ve bir Bunsen brülörünün alevinden geçirerek sterilize edin. Yarı katı bir ortam için, tüpü bir Bunsen brülörünün alevi altında açın. Bakterileri çıkarmak için steril bir iğne ve steril bir şırınga kullanın.
2. Bakterilerin hem manyetik hem de hareketli olduğundan emin olmak için asılı damla yöntemini8 kullanın.
   NOT: Faz kontrast mikroskobu harika sonuçlar verir, ancak zorunlu değildir. 10X ile 60X arasında değişen büyütmeler uygundur.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
AMB-1	Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC)	ATCC 700264
MS-1	ATCC	ATCC 31632
MSR-1	Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ)DSM	6361
L-sistein.HCl.H₂O	Sigma-Aldrich	C7880-100G
1.0 mL şırınga	Fischer scientific	B309659
25G x 1 iğne	BD	305125
125 mL serum şişeleri	Wheaton	223748
20 mm alüminyum contalar	Wheaton	224223-01
20mm EZ Crimper	Wheaton	W225303
Bütil-kauçuk tıpalar	Bellco Glass, Inc.	2048-11800
Hungate tüpleri	Chemglass (VWR)	CLS-4208-01
Septum tıpa, 13mm, Hungate	Bellco Glass, Inc.	2047-11600
Cam kültürü Tüpleri	Corning (VWR)	9826-16X