$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. MIC Panel Seyreltmelerini Hazırlayın
- Steril cam veya plastik tüplerde saf (saf) dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 1.600 μg/mL'den daha yüksek olmayan bir dalbavansin stok çözeltisi hazırlayın ve aynı hazırlama gününde kullanın veya ileride buz çözmeyen bir dondurucuda kullanmak üzere -20 ila -60 °C veya altında saklayın. Tozu tartarken, tozla birlikte alınan belgelerde belirtildiği gibi dalbavansinin gücünü göz önünde bulundurun.
- Stok seyreltmesini, steril cam veya plastik tüplerde düzgün DMSO ile şemaya benzer şekilde seyreltin. Seyrelticiyi ölçmek için bir pipet ve ilk dalbavancin stoğunu ilk tüpe eklemek için başka bir pipet kullanın. Sonraki her dalbavansin stok konsantrasyonu için yeni bir pipet kullanın.
- Temiz DMSO ile 100X nihai MIC panel konsantrasyon seyreltmelerini (ara konsantrasyonlar) hazırlayın. İstenen ara konsantrasyonu elde etmek için uygun hacimlerde kaynak ve DMSO'yu birleştirin (kullanılacak hacimler, yapılacak MIC panellerinin sayısına bağlı olacaktır).
- % 0.004 P80 hazırlayın: 4.9 mL dH₂O'ya 0.1 mL P80 ekleyerek% 2 P80'lik taze bir çalışma stoğu çözeltisi hazırlayın. 0.22 μm'lik bir filtreden geçirerek sterilize edin ve çözeltiyi hazırlandığı gün kullanın. % 2 P80'in 1:500 seyreltmesini yaparak% 0.004 P80 seyreltici hazırlayın (ör.., 0.3 mL %2 P80 ila 149.7 mL CAMHB).
- Ayrıca, ara konsantrasyonları 1:100 oranında seyreltin,% 0.004 (h / h) polisorbat-80 (P-80) ve / veya LHB (streptokoklar için) ile desteklenmiş katyon ayarlı Mueller Hinton suyu (CAMHB) son konsantrasyonun iki katında eklenir, çünkü aşı ilavesi 1: 2 seyreltme ile sonuçlanacaktır.
2. MIC Panellerini Hazırlayın
:
- Hazırlanan her bir dalbavansin solüsyonundan 50 μL'yi MIC panelinin uygun kuyucuklarına dağıtın ve ortamı yalnızca bir kuyucuğa dahil edin (büyüme kontrol kuyusu). Bu adım için steril uçlara sahip çok kanallı bir pipet kullanılabilir.
- Panelleri hemen kullanın veya plastik filmle kapatın, plastik torbalara koyun ve ihtiyaç duyulana kadar hemen ≤ -20 °C'de (tercihen ≤ -60 °C'de) buz çözülmeyen bir dondurucuya koyun. Donmuş paneller kullanılıyorsa, panel aşılamasına geçmeden önce contaları çıkarın ve tek tek panelleri 15-30 dakika (kuyu içeriği çözülene kadar) laboratuvar tezgahına yerleştirin.
3. MIC Panellerini Aşılayın, Saflık Yapın ve Koloni Sayımını Ayarlayın
- 18-24 saatlik bir kanlı agar veya diğer seçici olmayan agar plakasından iyi izole edilmiş birkaç koloni seçin. Her koloninin üst kısmına steril bir halka veya çubukla dokunun ve bulanıklık 0,5 McFarland standardına eşdeğer olana kadar 1-5 mL CAMHB veya saline aktarın. Bulanıklığı 0,5 McFarland ile görsel olarak karşılaştırarak veya fotometrik bir cihazla değerlendirin.
- Hazırlandıktan 15-30 dakika sonra, aşılamayı 1:100 oranında CAMHB (100 μL'den 10 mL CAMHB'ye) ile seyreltin. Dalbavancin'e karşı test edilen çoğu bakteri için, S. pneumoniae hariç, bu seyreltme 5 × 10 ° CFU / mL'lik bir nihai kuyu konsantrasyonu sağlayacaktır (kabul edilebilir aralık 2-8 × 10 ⁰ CFU / mL'dir). S. pneumoniae için, bulanıklığın 0.5 McFarland ile karşılaştırılmasına dayanan bakteri konsantrasyonu tipik olarak önemli ölçüde daha azdır. Bu nedenle, aşılamayı 1:25 oranında seyreltin (400 μL'den 10 mL CAMHB +% 10 LHB'ye).
- İnkülün hazırlanmasından sonraki 15 dakika içinde, hazırlanan MIC panelinin her bir oyuğuna (sterilite kontrol kuyusu hariç) 50 μL'lik son aşılamayı aktarın. Bu adım için steril uçlar kullanan çok kanallı bir pipet kullanılabilir.
- Steril bir halka kullanarak pozitif büyüme kontrol kuyusundan 1-10 μL'lik bir alikotu seçici olmayan bir agar'a (örneğin,% 5 koyun kanı içeren triptikaz soya agarı) aktararak ve yayarak bir saflık kontrolü yapın.
- Tek kanallı bir pipet ve steril uç ile büyüme kontrol kuyusundan 10 μL çıkararak ve 10 mL saline (1:1.000 seyreltme) aktararak koloni sayısını ayarlayın. 100 μL'yi tek kanallı bir pipet ve steril uç ile uygun bir seçici olmayan agar ortamına (örneğin, %5 koyun kanı içeren triptikaz soya agarı) karıştırın ve aktarın ve steril bir döngü ile tüm agar yüzeyine yayın, aşının eşit dağılımını sağlamak için farklı yönlerde iki kez tekrarlayın (1:10 seyreltme).
4. MIC Panellerini, Koloni Sayımını ve Saflık Plakalarını İnkübe Edin
- İnkübe etmeden önce her bir MIC panelini veya en fazla dört panelden oluşan yığını plastik bir torbada plastik bantla veya sıkıca oturan plastik bir kapakla kapatın. Alternatif olarak, en fazla 4 MIC panelinden oluşan yığının üstüne boş bir MIC paneli yerleştirin, nemli bir plastik kaba kağıt havlu koyun, MIC panellerini plastik kaba yerleştirin ve kabı bir kapakla güvenli bir şekilde kapatın. MIC panellerini, aşılamadan sonraki 30 dakika içinde 35-20 °C ± 2 °C'de 16-20 saat (stafilokoklar ve enterokoklar) ve 20-24 saat (streptokoklar) bir ortam havası inkübatöründe inkübe edin. Streptokokları %5'lik bir CO₂ inkübatörde inkübe etmek dışında, koloni sayısı ve saflık plakalarını aynı koşullar altında inkübe edin.
5. MIC ve Koloni Sayım Plakalarını okuyun; Saflık Plakasını Kontrol Edin
:
- MIC'i, çıplak gözle tespit edildiği gibi kuyucuklarda bakteri üremesini tamamen engelleyen en düşük konsantrasyon olarak okuyun.
- Koloni sayım plakasındaki kolonileri sayın. Her koloniyi seyreltme faktörü (1:10.000) ile çarpın (örneğin, 50 koloni 5 × 10⁵ CFU/mL'ye eşittir). Kabul edilebilir bir aralık 20-80 kolonidir (2-8 × 10⁵ CFU/mL) ve yaklaşık bir kılavuz olarak kullanılır.
- Saflık plakasını kontrol edin. Tüm koloniler her koloniye benziyorsa, aşı saf olarak kabul edilebilir. Başka koloniler varsa, MIC panelinde bir kirletici maddenin bulunma potansiyeli vardır ve test tekrarlanmalıdır.