Bakteriyel Enfekte Hücrelerde Endo-Lizozomal Yeniden Şekillenmenin Nanopartikül Aracılı Görselleştirilmesi

Özet

Kaynak: Zhang, Y., et al. Hücre içi bakteriler tarafından endo-lizozomal sistemin yeniden şekillenmesini incelemek için floresan nanopartiküllerin uygulanması. J. Vis. Uzm. (2015)

Bu video, hücre içi bakteriler tarafından enfekte edilmiş insan epitel hücrelerinde endo-lizozomal yeniden şekillenmeyi görselleştirmek için floresan nanopartiküllerin kullanımını göstermektedir. Bakteri istilasını takiben, patojenler konak hücre iskeletini ve endo-lizozomal sistemi manipüle ederek, vezikül taşınmasını değiştiren tübüler çıkıntılara sahip vakuoller oluşturur. Floresan olarak etiketlenmiş nanopartiküller daha sonra bu değişiklikleri izlemek için kullanılır ve patojen kaynaklı hücre içi kaçakçılık olaylarının yüksek çözünürlüklü görüntülenmesine olanak tanır.

Protokol

1. HeLa Hücrelerinin Kültürü
   1. LAMP1-GFP'yi (Lizozomla ilişkili membran glikoprotein 1-Yeşil floresan proteini) kalıcı olarak eksprese eden HeLa hücreleri, Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamında veya %10 fetal buzağı serumu (FCS) ile DMEM'de kültürlenir ve %5 CO₂ içeren bir atmosferde 37 °C'de büyütülür.
   2. Hücreleri 8 oyuklu bir oda slaytında (Ibidi) oyuk başına 50.000 yoğunlukta tohumlayın ve gece boyunca inkübe edin (O / N).
2. Bakteri Kültürü
   1. Salmonella enterica serovar Typhimurium NCTC 12023 vahşi tip (WT) suşu kullanın. Karşılaştırma için, SPI2-T3SS'de kusurlu mutantsuşlar Δ ssaV ve SIF için anahtar efektör SifA'dan yoksun ΔsifA kullanın. Gelişmiş GFP'nin yapısal ekspresyonu için plazmid pFPV25.1 barındıran suşları kullanın.
      NOT: Bakteri suşları, 50 μg/ml karbenisilin ilavesiyle Luria-Bertani suyunda (LB) (LB) ve 50 μg/ml karbenisilin ve / veya 50 μg/ml kanamisin (ΔssaV, ΔsifA) ilavesiyle rutin olarak kültürlenir.
   2. Tek bir bakteri kolonisini 3 ml LB'de uygun antibiyotiklerle aşılayın ve havalandırma için çalkalama koşulları altında 37 ºC'de O/N'yi büyütün, ardından taze LB'de 1:31 oranında seyreltin ve 3,5 saat büyümeye devam edin. Bu zaman noktasında, kültürler geç log fazına ulaşır ve bakteriler oldukça istilacıdır. Test tüpü kültürlerini havalandırma ile inkübe etmek için bir 'silindir tamburu' uygundur.
3. HeLa hücrelerinin Salmonella ve Altın-BSA-Rhodamine Nanopartikülleri veya NP'ler tarafından enfeksiyonu Nabız Takip etiketlemesi (şema için Şekil 1'e bakın)
   1. Alt kültürlenmiş bakterilerin OD_600'ünü ölçün ve 1 ml Fosfat tamponlu salin veya PBS'de OD₆₀₀ = 0.2'ye seyreltin (~ 3 × 10⁸ cfu / ml), 100'lük bir enfeksiyon çokluğu (MOI) elde etmek için 8 oyuklu odacıklı slaytlarda HeLa hücrelerine uygun miktarlarda bakteri ekleyin.
   2. Hücre inkübatöründe 30 dakika inkübe edin, içselleştirilmemiş bakterileri uzaklaştırmak için PBS ile 3 kez yıkayın (bu zaman noktası enfeksiyondan 0 saat sonra veya 0 saat PI olarak ayarlandı). 100 μg/ml gentamisin içeren 300 μl taze kültür ortamı ekleyin ve 1 saat koruyun. Daha sonra inkübasyon süresinin geri kalanı için ortamı 10 μg / ml gentamisin içeren taze ortamla değiştirin.
   3. 1 saat boyunca 100 μg / ml gentamisin içeren kültür ortamı ile inkübasyondan sonra, ortam, 10 μg / ml gentamisin içeren görüntüleme ortamı (FCS, L-glutamin, fenol kırmızısı ve sodyum bikarbonat, 30 mM HEPES, pH 7.4 ile Eagle's MEM) ile değiştirilir. Altın-BSA-rodamin NP'leri, OD₅₂₀ = 0.1'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için HeLa hücrelerine eklenir. (Sığır Serum Albümini veya BSA)
      NOT: Altın-BSA-rodamin NP'leri de enfeksiyondan önce veya çeşitli zaman noktalarında hücrelere eklenebilir.
   4. 1 saatlik inkübasyondan sonra, ortamı çıkarın, PBS ile 3 kez yıkayın ve inkübasyon süresinin geri kalanında %10 FCS ve 10 μg/ml gentamisin içeren 300 μl taze görüntüleme ortamı ekleyin.
      NOT: İnkübasyon süresi, NP'lerin konsantrasyonuna ve kullanılan hücre hatlarına bağlı olarak değişebilir. RAW264.7 makrofajları için, OD₅₂₀ = 0.05 konsantrasyonunda NP'lerle 30 dakikalık inkübasyonun yeterli içselleştirmeye izin verdiğini gözlemledik.

Sonuçlar

Şekil 1. Canlı hücre görüntüleme için HeLa hücrelerinin hazırlanması şeması. HeLa hücreleri, 30 dakika boyunca hazne slaytlarına ekildi, sahte enfekte oldu veya çeşitli Salmonella suşları ile enfekte edildi, 3 kez PBS ile yıkandı, daha...

Malzemeler