Mycobacterium tuberculosis'in Demir Sınırlı Koşullar Altında Kültürlenmesi

Özet

Kaynak: Gupta, S., ve diğerleri. Demir Sınırlı Mikobakteriler Tarafından Üretilen Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu ve Karakterizasyonu. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu video, demir stresini indüklemek ve bakterilerin hayatta kalmasını destekleyen sideroforların salgılanmasını teşvik etmek için Mycobacterium tuberculosis'in demir sınırlı koşullar altında kültürlenmesi prosedürünü göstermektedir.

Protokol

1. Demirin Sınırlı Olduğu Koşullarda Mikobakteri Yetiştirmek

1. Dondurulmuş %15 gliserol Mtb (Mycobacterium tuberculosis) stoğunun 50 μL'sini çözün ve %10 ADN (Albümin – Dekstroz – NaCl) zenginleştirmesi (5 g/L albümin, 2 g/L dekstroz ve 0.85 g/L sodyum klorür, %0.2 gliserol ve %0.05 Tween-80) ile desteklenmiş bir agar plakasını çizin. Koloniler görünene kadar plakayı 37 °C'de inkübe edin.
2. ADN zenginleştirmesi ile desteklenmiş 2 mL mikobakteriyel et suyu ortamında (Malzeme Tablosu) tek bir Mtb kolonisini aşılayın. 37 °C'de çalkalama ile inkübe edin.
3. Mtb kültürünün geç logaritmik faza kadar büyümesine izin verin (OD₅₄₀ ~0.8'dir). Bunu kontrol etmek için OD_540'ı bir spektrofotometre kullanarak ölçün.
4. 200 μL geç logaritmik kültürü,% 0.2 gliserol,% 0.05 Tween-80 ve ADN ile desteklenmiş mikobakteriyel agar plakalarına (Malzeme Tablosu) yayın. En az 5 tabak aşılayın. Plakaları, bakteri üremesi birleşik bir tabaka olarak görünene kadar 37 °C'de inkübe edin. Bu, Mtb için ~1 hafta sürer.
5. Steril bir pamuklu çubuğu LIMM'de (düşük demirli minimal ortam) ıslatın. Agar plakalarından bakteri toplamak için bu swabı kullanın ve OD 540 ~1.0 ile konsantre bir bakteri süspansiyonu hazırlamak için₁₀₀ mL LIMM aşılayın.
6. Bu süspansiyonu LIMM ile 10 kez 1 L'ye seyreltin ve her biri 500 mL kültür içeren iki adet 2 L steril plastik şişeye bölün.
7. 2 mL kültür alın ve 5 mL'lik bir kültür tüpüne aktarın. 10 μL %10 hacim/hacim tiloksapol ekleyin.
8. Kültürleri 37 °C'de 14 gün inkübe edin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Middlebrook 7H10 Agar	BD Difco	262710	Mikobakteriyel agar plakları
Middlebrook 7H9 Et Suyu	BD Difco	271310	Mikobakteriyel et suyu ortamı
Polipropilen ince cidarlı santrifüj tüpü 13x15 mm	Beckman Coulter	344059	Polipropilen ince cidarlı santrifüj tüpü 13x15 mm
Vakumlu filtrasyon şişeleri	Hücre Pro	V50022 Serisi	Filtre Ünitesi