Mycobacterium tuberculosis'ten Siderofor İçeren Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu

Özet

Kaynak: Gupta, S., Marcela Rodriguez, G. Demir Sınırlı Mikobakteriler Tarafından Üretilen Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu ve Karakterizasyonu. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu video, konakçı ortamı taklit eden demir sınırlayıcı koşullar altında kültürlenen Mycobacterium tuberculosis'ten hücre dışı veziküllerin (EV'ler) aşamalı izolasyonunu göstermektedir. EV içeren fraksiyonları zenginleştirmek ve tanımlamak için ultrafiltrasyon, diferansiyel santrifüjleme ve yoğunluk gradyanı ayırmanın kullanımını özetlemektedir.

Protokol

1. Mikobakteriyel Hücre Dışı Veziküllerin (MEV'ler) Toplanması

1. Toplama sırasında 2 mL kültürün OD_540'ını ölçün. Kültürün 1:10 seri seyreltmelerini yapın ve ADN ve% 0.05 Tween-80 ile agar plakaları üzerinde her seyreltmenin 100 μL'sini plakalayın.
2. Kültürü beş adet 225 mL konik santrifüj tüpüne aktarın ve 20 ° C'de 7 dakika boyunca 2.850 x g'da santrifüjleyin.
3. Kültür süpernatanını 50 mL'lik bir pipetle toplayın ve 0,22 μm'lik bir filtre ünitesinden filtreleyerek sterilize edin.

2. MEV'lerin İzolasyonu

1. Kültür süzüntüsünü 4 °C'ye yerleştirilmiş karıştırılmış bir hücre ultrafiltrasyon sistemine aktarın ve konsantreyi <50 psi'de 100 kDa'lık bir kesme membranından ~50 mL'ye filtreleyin.
2. Konsantre kültür süzüntüsünü 4 ° C'de 15 dakika boyunca 15.000 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı toplayın.
3. Kültür süzüntüsünü polikarbonat ultrasantrifüj tüplerinde 100.000 x g'da 4 °C'de 2 saat santrifüjleyin.
4. Membranöz peletleri toplam 1 mL steril fosfat tamponlu salin (PBS) içinde nazik pipetleme ile yeniden süspanse edin.
5. Adım 2.4'te elde edilen 0.5 mL pelet süspansiyonunu 1.5 mL %60 iyodiksanol çözeltisi ile karıştırın ve ağırlıkça %45 nihai iyodiksanol konsantrasyonu elde edin. Bu karışımı 13 mm x 51 mm polipropilen ince duvarlı ultrasantrifüj tüpünün dibine dağıtın.
6. MEV-iyodiksanol %45 süspansiyonunu 1 mL %40, %35, %30, %25 ve %20 (PBS'de hacim/hacim) iyodiksanol çözeltileri ve üstte 1 mL PBS ile kaplayın.
7. 4 °C'de 18 saat boyunca 100.000 x g'da santrifüjleyin.
8. 1 mL'lik bir Hamilton şırıngası kullanarak üstten başlayarak 1 mL yoğunluk gradyan fraksiyonlarını toplayın.
9. Toplanan her fraksiyonu PBS ile 20 mL'ye seyreltin ve 4 °C'de 2 saat boyunca 100.000 x g'da santrifüjleyin.
10. Süpernatanı çıkarın ve peleti 0,5 mL PBS içinde süspanse edin. Bu peleti 4 °C'de saklayın.

Malzemeler