$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Bakteri suşları ve kültürleme koşulları
NOT: Bu çalışmada kullanılan bakteri suşları Escherichia coli MP1, Akkermansia mucinophila, Bacteroides thetaiotaomicron, Bifidobacterium breve ve Bifidobacterium dentium idi.
1. E. coli için, tek kolonileri 250 ila 1.000 mL Luria-Bertani (LB) suyuna aşılamak için steril bir halka kullanın ve kültürü işlemeden önce 48 saat boyunca 300 rpm ve 37 °C'de çalkalayan bir inkübatörde aerobik olarak inkübe edin. için rekombinant E. koli p114-mCherryClyluc barındıran MP1 suşu, LB agarına kloramfenikol ekleyin ve 17 μg/mL'lik bir nihai konsantrasyonda et suyu ekleyin.
2. A. mucinophila, B. thetaiotaomicron, B. breve ve B. dentium için, Beyin Kalp İnfüzyonu (BHI) agar plakaları üzerinde çizgi çizin ve bir vinil anaerobik oda içinde anaerobik olarak inkübe edin. Tek kolonileri 100 mL önceden indirgenmiş BHI suyuna aşılayın ve anaerobik olarak 48 saat inkübe edin.
2. EV izolasyonu
1. Bakteri kültürü ortamının santrifüjleme ve filtrasyon ile arıtılması
1. 250 mL veya 500 mL polipropilen santrifüj şişelerini temizlemek için adım 1'de aşılanan bakteri hücre kültürlerini dökerek aktarın. Şişeleri büyük kapasiteli, sabit açılı bir rotorda 4 °C'de ve 5.000 × g'da 15 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice dökerek temiz santrifüj şişelerine aktarın ve 15 dakika boyunca 10.000 × g'da tekrar santrifüjleyin.
NOT: Biyogüvenliğe uygun temizlik ve dekontaminasyondan sonra şişeleri yeniden kullanın.
1. İkinci santrifüjlemeden sonra büyük bakteri hücresi topakları mevcutsa, hücreleri daha fazla çıkarmak için santrifüjlemeyi temiz bir şişede tekrarlayın.
2. Süpernatanı dökerek uygun boyutta 0,22 μm polietersülfon vakumla çalışan bir filtre cihazına aktarın. Filtrasyon cihazını bir vakum duvar kaynağına bağlayarak filtreleyin. Filtrasyon hızı önemli ölçüde düşerse, filtrelenmemiş malzemeyi yeni bir cihaza taşımanız yeterlidir. Filtrelenen ortamı gece boyunca 4 °C'de saklayın ve istenirse ertesi gün protokole devam edin.
NOT: Yukarıdaki santrifüjler tipik olarak her bir cihaz aracılığıyla belirtilen hücre kültürü hacminin ~2 katının işlenmesine izin verir. Örneğin, tek bir 500 mL filtre cihazı ~1.000 mL önceden santrifüjlenmiş kültürü filtreleyebilir. Bu cihazlar genellikle yeniden kullanılmaz. Test edilen modellerde önemli kayıplar kaydedildiğinden, bu adımda şırınga filtrelerinin kullanılması optimizasyon olmadan önerilmez. Bu potansiyel bir durma noktasıdır.
3. Filtrelenmiş süpernatantın bir kısmını uygun agar plakalarına yayarak bu noktada canlı hücrelerin tamamen çıkarılıp çıkarılmadığını kontrol edin ve bakteri suşu için optimum koşullarda inkübasyondan sonra herhangi bir koloninin bulunmadığından emin olun. Bakteri tespit edilirse, ek santrifüjlemeler ve/veya filtrelemeler gerçekleştirerek yukarıdaki prosedürü daha da optimize edin.
2. Filtrelenmiş ortamın konsantrasyonu
1. Önemli ölçüde >100 mL'lik hacimlerle çalışıyorsanız, adım 2.2.2'ye geçin. ~100 mL'lik hacimlerle çalışıyorsanız, serolojik pipetler kullanarak ilgili kapasiteli 100 kDa moleküler ağırlık kesme (MWCO) santrifüj ultrafiltrasyon cihazının rezervuarına 90 mL filtrelenmiş kültür ortamı yükleyin. Her zaman uygun bir ultrafiltrasyon cihazı ile dengeleyin ve üst rezervuardaki ortamın hacmi <0,5 mL'ye konsantre olana kadar 15-30 dakikalık aralıklarla 4 °C ve 2.000 × g'da sallanan bir kova rotorunda santrifüjleyin.
1. Rezervuarı kalan filtrelenmiş kültür ortamıyla doldurun. "Doldurma" yapıyorsanız, cihazın altındaki akışı kaldırın ve tüm cihazları yeniden dengeleyin.
NOT: Bu cihazlar kullanılarak konsantre edilebilecek maksimum filtrelenmiş kültür ortamı hacminin önerilen hacmin <2 katı olduğu görülmüştür.
2. Rezervuardaki konsantre ortamın viskozitesi gözle görülür şekilde artarsa (koyu, viskoz malzeme), fosfat tamponlu salin (PBS) ile seyreltin ve 100 kDa'lık MWCO'dan daha küçük EV olmayan proteinleri seyreltmek için santrifüjleme yoluyla yeniden konsantre edin.
NOT: Bu potansiyel bir durma noktasıdır.
3. Konsantre ortamı düşük protein bağlayıcı bir tüpe aktarın, gece boyunca 4 °C'de saklayın ve istenirse ertesi gün protokole devam edin.
2. Önemli ölçüde >100 mL'lik hacimlerle çalışıyorsanız, işlenecek hacmi karşılamak için uygun boyutta bir teğetsel akış filtreleme (TFF) cihazı (100 kDa MWCO) seçin.
NOT: 100 mL ila >1.000 mL arasında işleme için filtrasyon cihazları ticari olarak mevcuttur. Yerel bulunabilirlik, maliyet ve pompa ve boru/bağlantılarla uyumluluk, hangi modellerin en kullanışlı olacağını belirleyecektir. Filtreyi temizlemeye gerek kalmadan önce Malzeme Tablosunda belirtilen cihazla 2 L'ye kadar kültür ortamı işlenmiştir (temizleme protokolü için aşağıdaki adım 2.3'e bakın).
1. #16 düşük bağlamalı/düşük sızıntılı boru, Luer adaptörlerine 1/8 inç hortum dikeni, TFF cihazı ve peristaltik pompa içeren bir filtreleme devresi monte edin.
NOT: EV preparatının çevresel bakterilerle kirlenme riskini en aza indirmek için TFF'yi bir biyogüvenlik kabini içinde gerçekleştirin.
2. Oda sıcaklığında, filtrelenmiş, şartlandırılmış ortamı yaklaşık 200 mL/dk'da (minimum 100 mL/dk) sirküle etmeye başlayın. Dereceli bir kaba 200 mL PBS pompalayarak istenen akış hızına karşılık gelen uygun RPM'yi belirleyin. Filtrelenmiş, şartlandırılmış ortamı dolaştırırken, ultrafiltrasyon membranından geçen <100 kDa moleküllerini ayrı bir kapta atık olarak toplayın.
NOT: Aşağıdaki örnek, 2 L kültürün başlangıç hacmini varsayacaktır.
3. Hacmi ~ 100-200 mL'ye düşene kadar şartlandırılmış ortamı sirküle etmeye devam edin. Gerektiğinde daha küçük gemilere geçin. PBS ile 2 kat seyreltin ve 75-100 mL'ye kadar konsantre olarak pompa ile sirküle etmeye devam edin. PBS ile 2 kat seyreltin ve 25 mL'lik bir son hacme kadar sirküle etmeye devam edin. PBS ile 2 kat seyreltin ve <10 mL'ye kadar dolaşıma devam edin.
4. Besleme borusunu numune haznesinden kaldırın ve filtreyi boşaltmak ve maksimum miktarda numuneyi geri kazanmak için pompalamaya devam edin.
NOT: Bu potansiyel bir durma noktasıdır.
5. Konsantre numuneyi konik bir tüpe aktarın ve istenirse gece boyunca 4 derecede saklayın. Alternatif olarak, protokole devam edin.
6. Konsantre numuneyi 15 mL kapasiteli 100 kDa MWCO santrifüj ultrafiltrasyon cihazına taşıyın. Üst rezervuardaki ortamın hacmi <2 mL'ye konsantre olana kadar 15-30 dakikalık aralıklarla 4 °C ve 2.000 × g'da sallanan bir kova rotorunda santrifüjleyin.
NOT: Bu potansiyel bir durma noktasıdır.
7. Konsantre ortamı düşük protein bağlayıcı bir tüpe aktarın ve gece boyunca 4 derecede saklayın, istenirse ertesi gün protokole devam edin.