$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Boyut dışlama kromatografisi (SEC)
NOT: SEC, hücre dışı veziküllerin (EV'ler) saflığını arttırmak ve veziküler olmayan proteini uzaklaştırmak için kullanılır.
- EV'lerin <100 mL başlangıç malzemesinden izolasyonu için küçük bir SEC kolonu (10 mL yatak hacmi) ve EV'lerin >100 mL başlangıç malzemesinden izolasyonu için daha büyük bir kolon (47 mL yatak hacmi) kullanın.
NOT: Aşağıdaki örnekte, daha büyük sütun için birimler, daha küçük sütun için birimler parantez içinde listelenecektir. - SEC kolonunu ve fosfat tamponlu salini (PBS) birkaç saat boyunca oda sıcaklığına getirin. Standart bir laboratuvar standı ve tutucu kullanarak SEC kolonunu dikey konumda sabitleyin. Alternatif olarak, ticari kromatografi kolon standlarını kullanın.
- SEC kolonuna bağlamadan önce, 5 mL PBS'nin fritten bir atık kabına akmasına izin vererek numune rezervuarını nemlendirin. SEC kolonunun giriş kapağını sökün, numune rezervuarına 2 mL PBS ekleyin ve PBS fritten damlarken rezervuarı kolona dikkatlice bağlayın (küçük SEC kolonları için geçerli değildir). NOT: Bu önceki adım, herhangi bir hava kabarcığının SEC sütununun üst kısmında sıkışmasını önler. Hava sıkışmışsa, rezervuarı çıkarın, hava kabarcığını çıkarmak için sütuna dokunun ve bağlantı prosedürünü tekrarlayın. Daha küçük sütun için, SEC sütununun üst kısmının kapağını açmanız ve numune haznesini takmanız yeterlidir.
- Numune rezervuarına 47 mL (10 mL) PBS ekleyin ve SEC sütununun alt kısmını açın. Yüklenen tüm numune tamponunun dengeleme için kolondan akmasına izin verin. Akışı atın.
- Numune haznesine maksimum 2 mL (0,5 mL) numune yükleyin, akışı atın ve numunenin kolona tamamen girmesine izin verin.
- PBS'yi hemen numune rezervuarına veya haznesine 14,25 mL eksi numune hacmi (küçük kolon için 3 mL eksi numune hacmi) hacminde ekleyin. Çözeltinin kolondan akmasına izin verin ve kolon boşluğu hacmine eşit olan bu miktarı atın.
NOT: Tipik bir 2 mL numune için, numune haznesine veya hazneye eklenecek PBS miktarı 12.25 mL olacaktır. - 2 mL'lik düşük bağlayıcı bir mikrotüpü doğrudan SEC kolonunun altına yerleştirin. Numune rezervuarına hemen 2 mL (0,5 mL) PBS ekleyin ve kolona girmesine izin verin. İlk 2 mL (0,5 mL) akışı Fraksiyon 1 olarak etiketleyin. Sonraki her fraksiyonu toplamak için numune rezervuarına bir seferde 2 mL (0,5 mL) eklemeye devam edin.
NOT: Çoğu bakteriyel EV, ilk 5 fraksiyonda ayrışır. Optimizasyon sırasında ilk 12 kesir toplandı. - Fraksiyonları kısa süreli depolama (gün) için 4 °C'de veya uzun süreli depolama için -80 °C'de saklayın.