İmmünolojik Sinaps Oluşumu Yoluyla T Hücrelerinin İn Vitro Bakteriyel Transenfeksiyonu

Özet

Kaynak: Cruz-Adalia, A., ve diğerleri. T Hücreleri, Dendritik Hücrelerden Transenfeksiyon Yoluyla Bakterileri Yakalar. J. Vis. Uzm. (2016).

Bu video, antijene özgü T hücresi-dendritik hücre etkileşimleri yoluyla bakteriyel transenfeksiyonu göstermektedir. Ovalbümin peptidi sunan bakteri ile enfekte dendritik hücreler, doğrudan veya bir zarla ayrılmış T hücreleri ile inkübe edilir. Doğrudan temas, immünolojik sinaps oluşumuna izin vererek bakteri transferini sağlarken, zar etkileşimi engeller. Gentamisin tedavisi daha sonra hücre dışı bakterileri yok etmek için yapılır.

Protokol

Not: Fareler spesifik patojen içermeyen (SPF) muhafazalarda yetiştirildi ve eğitimli ve kalifiye personel tarafından karbondioksit (CO₂ ) inhalasyon yöntemi kullanılarak ötenazi yapıldı.
1. Fare Kemik İliğinden Kaynaklanan Dendritik Hücreler (DC'ler) Farklılaşması ve EnfeksiyonNot: Şekil 1 bu ilk adımı özetlemektedir. Bu noktadan itibaren tüm işlemler davlumbazda sadece steril ortam, aletler, pipet uçları ve kültür kapları kullanılarak gerçekleştirilmelidir.

1. Fare Kemik İliğinden Türetilen DC'lerin Farklılaşması
   1. Bir C57/BL6 faresinden kaval kemiği ve femurları inceleyin ve bunları 10 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ortamı içeren plastik bir kaba aktarın.
   2. Her epifizi steril makasla kesin ve karakteristik parlak kırmızı renge sahip kemik iliğini açığa çıkarın.
   3. Steril bir Petri kabı üzerinde steril bir şırınga kullanarak kemiğin içini% 0.5 sığır serum albümini (BSA) ve 5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) (PBS / BSA / EDTA tamponu) içeren 10 ml fosfat tamponlu salin (PBS) ile infüze edin.
   4. Hücre süspansiyonunu ve santrifüjü, soğutulmuş bir santrifüjde (4 °C) 600 x g'da bir tüp içinde toplayın.
   5. Hücreleri 1 ml Amonyum-Klorür-Potasyum (ACK) parçalama tamponu (0.15 M Amonyum Klorür (NH₄Cl), 10 mM Potasyum Bikarbonat (KHCO₃ ) ve 0.1 mM EDTA) içinde yeniden süspanse edin ve kırmızı kan hücrelerini yok etmek için oda sıcaklığında (RT) 30 saniye inkübe edin.
   6. %10 fetal sığır serumu (FBS) ile 10 ml RPMI 1640 ortamı ekleyin ve aynı hızda (600 xg) santrifüjlemeden önce kemik parçalarını ve hücre kümelerini çıkarmak için bir hücre süzgecinden (70 μm) süzün, çünkü kümeler filtreleme ile elimine edildi.
   7. Hücreleri sayın ve RPMI %10 FBS (50 μM B-merkaptoetanol, 1 mM sodyum piruvat içerir) ile 5 x 10^{5 hücre} /ml'ye ayarlayın ve 20 ng/ml rekombinant murin granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (rm-GM-CSF) son konsantrasyon olarak.
   8. Bu süspansiyonu steril, mikrobiyolojik kalitede, 15 cm'lik bir Petri kabına ve bir CO₂ inkübatöründe (37 ° C,% 5 CO_{2 )} kültüre ekleyin.
   9. Her üç günde bir, PBS'de 5 mM EDTA ile hem yapışık olmayan hücreleri hem de ayrılmış hücreleri döndürün ve 20 ng/ml rm-GM-CSF içeren taze ortam ile 5 x^{10 5} hücre/ml hücre yoğunluğunda yeniden süspanse edin.
2. DC'lerin Olgunlaşması ve Antijen Yüklemesi
   1. 9. günde, hücreleri 20 ng / ml rm-GM-CSF içeren bir ortamda 5 x 10⁵ hücre / ml yoğunlukta yeniden süspanse edin. Daha sonra, hücreler üzerinde yüksek Majör Histouyumluluk Kompleksi veya MHC-II ekspresyonuna izin vermek için 20 ng/ml lipopolisakkarit (LPS) ekleyin ve doku kültürü ile muamele edilmemiş steril 15 cm'lik bir Petri kabında 24 saat inkübe edin.
   2. Bir günlük LPS stimülasyonundan sonra, akış sitometrisi ile DC farklılaşmasını kontrol etmek için bazı DC hücrelerini fare CD11c, MHC-II ve Granülosit reseptörü-1 veya Gr-1'e karşı antikorlarla boyayın. DC'lerin akış sitometrisi analizinin bir örneği Şekil 3A ve 3B'de gösterilmektedir.
      1. DC'leri (5 x 10⁵ hücre/numune) bir anti-fare-CD16/CD32 monoklonal antikoru ile numune başına 50 μl PBS/BSA/EDTA tamponunda 2.5 μg/ml nihai konsantrasyonda inkübe edin. Daha sonra, PBS/BSA/EDTA tamponunda sırasıyla 1:100, 1:200 ve 1:500'de farklı florokromlarla konjuge edilmiş MHC-II (I-A/I-E), CD11c ve Gr-1'e karşı 50 ul antikor ekleyin.
      2. Son olarak, DC'leri PBS/BSA/EDTA tamponu ile yıkayın ve üreticinin protokolüne göre akış sitometrisi ile analiz edin.
         Not: Hücreler iyi farklılaşmışsa, antijen yüklemesi için hazırdırlar.
   3. DC'leri RPMI %10 FBS (antibiyotiksiz) ile yıkayın ve 10 μg/ml OTII ovoalbümin peptidi (OVAp) ile inkübe edin (OVA 323-339; I S Q A V H A A H A E I N E A G R) 37 ºC'de en az 1 saat boyunca 5 x 10^{6 DC} başına 1 ml RPMI %10 FBS ortamında plastik bir tüp üzerinde. Negatif kontrol olarak, DC'leri OVAp ile inkübe etmeden bırakın.
3. DC'lerin enfeksiyonu
   1. DC'leri, bir CO₂ inkübatöründe (37 ° C, % 5 CO₂ ) 1 saat boyunca 10 bakteriden (DC başına 10 bakteri) oluşan çok sayıda enfeksiyonda (MOI) enfekte edin.
   2. DC hücrelerini 3x PBS'de ve 1x RMPI %10 FBS'de yıkayın ve hücre dışı bakterilerin çoğunu yıkamak için 450 x g'da santrifüjleyin. Son olarak, hücreleri RMPI %10 FBS ortamında (antibiyotiksiz) 20 x 10⁶ hücre/ml'de yeniden süspanse edin.

2. OTII Transgenik Farelerden CD4⁺ T Lenfositlerin İzolasyonuNot: Şekil 1 bu ikinci adımı özetlemektedir. CD4⁺ T hücrelerini izole etmek için dalak yerine lenf düğümleri kullanılmalıdır, çünkü lenf düğümlerindeki CD4⁺ lenfositlerin oranı (~%50) dalaktan (~%25) daha büyüktür ve bu nedenle saflaştırma daha etkili olacaktır.

1. Lenf düğümlerinin tek hücreli süspansiyonunu yapın
   1. OTII transgenik farelerden kasık, aksiller, brakiyal, servikal ve mezenterik lenf düğümlerini çıkarın ve bunları 10 ml RPMI %10 FBS ortamı içeren plastik bir kaba aktarın.
   2. İki buzlu mikroskop lamı kullanarak lenf düğümlerini steril bir başlık altında öğütün. Lenf düğümlerini bir mikroskop lamının buzlu tarafına yerleştirin ve organlar topraklanana kadar ikinci lamın buzlu tarafıyla ovalayın.
   3. Tek hücreli süspansiyonu PBS/BSA/EDTA tamponunda yıkayın.
   4. Bağ dokusunu çıkarmak için hücreleri bir hücre süzgecinden (70 μm) süzün ve PBS/BSA/EDTA tamponu ile yıkayın.
   5. Hücreleri 1 ml ACK lizis tamponunda yeniden süspanse edin ve kırmızı kan hücrelerini yok etmek için RT'de 1 dakika inkübe edin.
2. CD4⁺ T Hücrelerinin İzolasyonu
   1. Adım 2.1.3'teki gibi tekrar yıkayın ve hücreleri PBS/BSA/EDTA tamponunda 100 x 10⁶ hücre/ml'de yeniden süspanse etmek için sayın. CD4⁺ T hücrelerinin daha sonra negatif seçimi için 1:250'de buz üzerinde 30 dakika boyunca CD8, IgM, B220, CD19, MHC sınıf II (I-Ab), CD11b, CD11c ve DX5'e karşı biyotinlenmiş antikorlar ekleyin.
   2. Hücreleri PBS/BSA/EDTA tamponunda yıkayın ve hücreleri (100 x 10⁶ hücre/ml) streptavidin mikro boncukları ile üreticinin protokolünde önerilen konsantrasyonda buz üzerinde 15 dakika inkübe edin.
   3. Hücreleri PBS/BSA/EDTA tamponunda yıkayın ve CD4⁺ T hücre izolasyonundan önce bir hücre süzgecinden (30 μm) süzün.
   4. CD4⁺ T hücrelerini, üreticinin protokolüne göre bir manyetik hücre ayırma makinesi kullanarak negatif seçimle izole edin.
   5. Hücreleri sayın ve RPMI %10 FBS ortamı (antibiyotiksiz) ile 4 x^{10 6} hücre/ml'ye ayarlayın.
   6. Akış sitometresi ile saflığı kontrol etmek için buzla izole edilmiş CD4⁺ T hücrelerini (3 x 10⁵ hücre) sabitleyin ve saklayın. CD4⁺ T hücrelerinin saflaştırılmasının bir örneği Şekil 3C'de gösterilmektedir.

3. Gentamisin Koruma Testi ile T Hücresi Transenfeksiyon ÖlçümüNot: Şekil 2 , protokolün bu üçüncü adımını özetlemektedir.

1. T hücresi Transenfeksiyonu

1. Bir CO₂ inkübatöründe (37 °C, %5 CO₂) immün sinaps oluşumuna izin vermek için izole edilmiş CD4⁺ T hücrelerini enfekte DC hücreleri (1:1) ile (DC'ler 1 saat boyunca enfekte edildi ve serbest bakterileri yok etmek için yıkandı) 30 dakika inkübe edin.

2. 24 oyuklu bir kültür plakasına 0.5 ml izole CD4⁺ T hücresi (2 x 10⁶ hücre) ve 0.1 ml enfekte DC (2 x 10⁶ hücre) ekleyin. Negatif kontrol olarak, 30 dakika boyunca 10 bakteriden oluşan bir MOI'de 0,5 ml CD4⁺ T hücresini doğrudan enfekte edin.

3. DC-T'nin fiziksel temasını engelleyen bir polikarbonat transwell bariyeri (3 μm gözenek boyutuna sahip) kullanarak enfekte DC'leri T hücrelerinden ayıran ek kontroller ekleyin. Transwell'in içine 0.1 ml DC ve kuyucuğun alt bölmesine (24 oyuklu plaka) 0.5 ml CD4⁺ T hücresi ekleyin.

4. Son olarak, tüm numunelerde eşit hacimler elde etmek için her oyukta 0,6 ml olana kadar RMPI ortamı ile tamamlayın.

5. 30 dakikalık immün sinaps oluşumundan sonra, 100 μg/ml gentamisin ekleyin ve hücreleri bir CO₂ inkübatöründe (37 ° C,% 5 CO₂ ) toplamadan önce 1 saat inkübe edin .

Sonuçlar

Şekil 1. DC üretimi ve CD4⁺ T hücre izolasyonunun akış şeması. Şeklin sol tarafında, dendritik hücreleri (DC'ler) kemik iliği hücrelerinden ayırt etme süreci detaylandırılmıştır. Femur ve kaval kemiği diseke edildikten sonra kemik...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
devir sayısı	Fisher Bilimsel	SH3025501
r-GMCSF	Peprotech	315-03
LPS	SİGMA	L2630-10mg
Na piruvat	Termo Bilimsel	SH3023901
2-BEN	Gibco	31350-010
OVAp OTII (323–339)	GenScript	---
Hücre Süzgeci 70uM	BD	352350
30uM Şırınga Filcons Steril	BD	340598
AutoMac'ler Klasik	Miltenyi Biotec	130-088-887
Gentamisin	Normon	624601.6
Transwell	Yıldız	3415
LB	Pronadisa Hakkında	1231
Agar	Pronadisa Hakkında	1800
Paraformaldehit %16	Elektron Mikroskobu Bilimleri	15710
Triton X-100
CD8 biyot	BD Biyolojik Bilimler	553029
IgM Biyot	İmmünoadım	RMM-1'i klonlayın
B220 Biyot	BD Biyolojik Bilimler	553086
CD19 biyot	BD Biyolojik Bilimler	553784
MHC-II Biot (I-A/I-E)	BD Biyolojik Bilimler	553622
CD11b biyot	İmmünoadım	11BB-01mg
CD11c biyot	İmmünoadım	11CB3-01mg
DX5 biyot	BD Biyolojik Bilimler	553856
Gr-1 biyot	BD Biyolojik Bilimler	553125
CD16/CD32	İmmünoadım	M16PU-05MG
anti Salmonella	ABD Serotec	8209-4006
CD11cPE	BD Biyolojik Bilimler	553802
CD4-APC	Tonbo Biyolojik Bilimler	20-0041-U100
Gr-1 ZPT	BD Biyolojik Bilimler	553129
MHC-II (I-A/I-E) FITC	BD Biyolojik Bilimler	553623
Alexa-Fluor 647 Keçi Anti-Tavşan IgG (H+L) Antikoru, yüksek oranda çapraz adsorbe edilmiş	Davetli	A-21245 Serisi
CMAC (7-amino-4-klorometilkumarin)	Yaşam teknolojileri	C2110
BSA	SİGMA	A7030-100G
Streptavidin Mikro Boncuklar	Miltenyi Biotec	130-048-101
BD FACSCanto II	BD Biyolojik Bilimler	---