Sabit Medya Akışı Altında Primer İnsan Endotel Hücrelerine Pnömokok Bağlanmasının Değerlendirilmesi

Özet

Kaynak: Jagau, H. ve diğerleri. Sabit akışta birincil insan endotel hücrelerinin pnömokok enfeksiyonu. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu video, sabit ortam akış koşulları altında endotel hücreleri üzerindeki Von Willebrand Faktörü (VWF) dizilerine pnömokok bağlanmasının gerçek zamanlı görselleştirilmesini göstermektedir. VWF salınımını uyarmak, dizileri etiketlemek ve bakteri bağlanmasını ölçmek için adımları özetlemektedir.

Protokol

1. Von Willebrand Faktörünün (VWF) İndüksiyonu ve Çoklu Birleştirilmiş VWF Dizilerinin Görselleştirilmesi

1. VWF'nin 200 MDa'ya kadar uzun dizilere multimerizasyonunu tetiklemek için 10 din/^cm2'lik bir kayma gerilimi gerektiğinden akış ayarını koruyun. Bir enjeksiyon portu kullanarak perfüzyon tüpünde dolaşan ek karışım (ECGMS)-ortam ile endotel hücre büyüme ortamına 136 μL 100 mM histamin stok çözeltisi enjekte ederek endotelyal WPB'den VWF salınımını indükleyin. Akış ortamındaki nihai histamin konsantrasyonu 1 mM olacaktır. Enjeksiyon portu yoksa, histamin alternatif olarak pompa rezervuarlarının ortamına pipetlenerek eklenebilir.
2. Multimerize VWF dizilerinin immünofloresan tespiti için, rezervuarlarda dengeli bir ortam seviyesine ulaşıldığında akışı durdurun ve 200 μL fosfat tamponlu salin (PBS) (pH 7.4) hacminde 20 μg VWF'ye özgü floresein izotiyosiyanat (FITC) konjuge antikoru enjekte edin bir enjeksiyon portu kullanarak dolaşımdaki 13.6 mL ECGMS ortamına. Enjeksiyon portu yoksa, antikor alternatif olarak pompa rezervuarlarının ortamına pipetlenerek eklenebilir. Bu, 1.3 μg/mL'lik bir nihai antikor konsantrasyonu ile sonuçlanır.
3. Kısa sürede birkaç görüş alanının mikroskobik taraması için, mikroskobun floresan ünitesini %30 güçte bir Xenon floresan cihazı ve bir epifloresan kamera ile kullanın. VWF dizileri görselleştirmesine uygun temsili hücreleri seçmek için parlak alan modu ile insan göbek damarı endotel hücresi (HUVEC) tabakasının şeklini ve morfolojisini izleyin.
4. Yeşil floresan VWF dizilerinin görselleştirilmesi için, mikroskop yazılımının (LasX) floresan ünitesi menüsünde 63x/1.40 yağ objektifi ve 470 nm algılama filtresi seçin. Her biri morfolojik olarak bozulmamış yaklaşık 10 HUVEC içeren en az 50 temsili alan görünümünden oluşan Z yığınlarının anlık görüntülerini oluşturun. Farklı zaman noktalarında yeşil floresan VWF dizilerinin nicelleştirilmesi için birkaç görüş alanını tarayın.

2. Gerçek Zamanlı Akışta VWF dizilerine Bakteriyel Bağlanmanın Mikroskobik Değerlendirmesi

1. İmmünofloresan tespiti yoluyla HUVEC hücre yüzeylerinde üretilen VWF dizilerine pnömokok bağlanmasını ölçün.
   1. Akışı tutun ve enjeksiyon portunu kullanarak ECGMS ortamına maksimum 1 mL hacimde 1.35 x^{10 8} CFU/mL kırmızı floresan proteini (RFP) eksprese eden pnömokok enjekte edin. Alternatif olarak, bakterileri pompa haznesindeki ortama pipetleyin. Bakterilerin pompa sistemi içinde dolaşmasına izin vermek için kesme gerilimini 10 dyn/^cm2'de yeniden başlatın.
   2. Mikroskop büyütme için 63x yağa daldırma objektifi seçin ve RFP eksprese eden pnömokokların tespiti için mikroskop yazılımındaki floresan filtre ayarlarını RFP kanalına (540 nm algılama filtresi) ayarlayın.
   3. VWF dizilerine bakteri bağlanmasının nicelleştirilmesi için, akışı durdurun ve her biri yaklaşık 10 morfolojik olarak bozulmamış HUVEC içeren en az 30 temsili alan görünümünden oluşan Z yığınlarının anlık görüntülerini oluşturun ve pnömokok sayısını sayın.
   4. Verileri değerlendirmek için ANOVA tek faktörlü istatistik algoritmasını kullanın, ardından ayrıntılı istatistiksel karşılaştırma için post hoc iki kuyruklu eşleştirilmemiş örnek testi kullanın. P değerleri <0,05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

Malzemeler