Zebra Balığı Embriyolarında Biyomateryalle İlişkili Bakteriyel Enfeksiyonun Floresan Görüntülemesi

Özet

Kaynak: Zhang, X., ve diğerleri. Biyomateryalle İlişkili Staphylococcus aureus Enfeksiyonunun İn Vivo Görselleştirmesi ve İntravital Analizi için Zebra Balığı Embriyo Modeli. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu video, Staphylococcus aureus enjekte edilen zebra balığı embriyolarının floresan görüntülemesini göstererek, biyomateryal mikrokürelerin in vivo konakçı-patojen etkileşimleri üzerindeki etkisini değerlendirmek için enfeksiyon ilerlemesinin ve bakteri dağılımının ölçülmesini sağlar.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Zebra Balığı Embriyolarında Enfeksiyon İlerlemesinin ve Provoke Edilmiş Hücre İnfiltrasyonunun Floresan Mikroskobu

1. Embriyoları uyuşturmak için %0,02 (a/h) 3-aminobenzoik asit (Trikain) içeren 100 mm'lik bir Petri kabına yerleştirerek uyuşturun. 5 dakika sonra, embriyoları %0.02 (a/h) Trikain içeren E3 ortamı ile kaplanmış agaroz plakasına aktarın ve enjeksiyon için tek yönde hizalayın. 500 μL PBS (fosfat tamponlu salin)-%2 (ağırlıkça) metilselüloz çözeltisini, %0.02 (a/h) Trikain içeren E3 ortamı içeren bir Petri kabına pipetleyin. Embriyoları metilselüloz çözeltisine yerleştirin ve düz ve yatay tutun.
   NOT: Metilselüloz çözeltisi, viskozitesi nedeniyle embriyoları görüntüleme için en iyi yönde geçici olarak hareketsiz hale getirebilen bir "yapıştırıcı" olarak kullanılır.
2. Tek tek embriyoları 160x büyütmede aynı optimize edilmiş ayarlar (örn. yoğunluk , kazanç ve maruz kalma süresi) altında görüntülemek için parlak alan, mCherry, yeşil floresan protein (GFP) ve UV (ultraviyole) filtreleriyle donatılmış bir stereo floresan mikroskobu kullanın. Odak düzlemini, parlak alan filtresini kullanarak enjeksiyonun neden olduğu doku hasarı odakta olacak şekilde ayarlayın. Z yığını derinliğini 10 μm'ye ve adım boyutunu 5 μm'ye ayarlayın, bu da art arda 3 görüntünün kaydedilmesine olanak tanır.
3. Enjeksiyondan 5 saat sonrasından enjeksiyondan 2 gün sonrasına kadar günde bir kez tek tek embriyoları görüntüleyin. Daha fazla görüntüleme ve analiz için ölü embriyoları (kalp atışı yok veya embriyo kısmen bozulmuş) hariç tutun. Embriyoları 48 oyuklu plakalarda E3 ortamında ayrı ayrı tutun. Ortamı günlük olarak yenileyin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
10 μm çapında polistiren mikroküreler (mavi floresan)	Yaşam teknolojisi/ThemoFisher	F8829 Serisi
3-aminobenzoik asit (Trikain)	Sigma-Aldrich	E10521-50G
Stereo floresan mikroskop LM80	Leica	MDG3610450126
Metil selüloz 4000cp	Sigma-Aldrich	MO512-250G
Petri kabı	Doğan	353003
Petri kabı	Biyomeriux	NL-132
ResimJ	Uygulanamaz	Uygulanamaz	Bağlantı: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Grafik Tuş Takımı 7.0	Prizma	Uygulanamaz