Zebra Balığı Embriyoları Kullanılarak İmplantla İlişkili Bakteriyel Enfeksiyonların İn Vivo Analizi

Özet

Kaynak: Zhang, X. ve diğerleri, Biyomateryalle ilişkili Staphylococcus aureus Enfeksiyonunun İn Vivo Görselleştirmesi ve İntravital Analizi için Bir Zebra Balığı Embriyo Modeli. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu video, implante edilmiş biyomateryallerle bağlantılı enfeksiyonları incelemek için bir zebra balığı embriyo modelini göstermektedir. Staphylococcus aureus'un polistiren mikrokürelerle enjekte edilmesi, implante edilen materyallerin enfeksiyonu teşvik edici rolünü doğrulayarak bakterilerin hayatta kalmasını artırır.

Protokol

1. Sadece Bakteri ve Bakteri Mikroküre Süspansiyonlarının Hazırlanması

NOT: mCherry floresan proteinini (S. aureus-mCherry) eksprese eden Staphylococcus aureus RN4220 suşu kullanılır. S. aureus RN4220 suşu, virülans düzenleyici gen agrA'da (aksesuar gen düzenleyici A) mutasyona uğramıştır ve bu nedenle zebra balığı embriyo modelinde nispeten düşük virülansa sahip olabilir. Biyomateryalle ilişkili enfeksiyon (BAI) için diğer S. aureus suşları veya diğer bakteri türleri kullanılabilir.

1. 10 μg/mL kloramfenikol ile desteklenmiş triptik soya agar kültür plakalarından 4 ila 5 koloni S. aureus RN4220 bakterisi alın ve bakterileri çalkalama altında 37 °C'de 10 μg/mL kloramfenikol ile desteklenmiş 10 mL triptik soya suyunda orta logaritmik büyüme fazına kadar kültürleyin.
   1. Kültür sırasında, 620 nm'de (OD₆₂₀) optik yoğunluk (OD) ölçümü için bir küvette (1 cm genişlik) 900 μL steril fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 100 μL bakteri süspansiyonunu seyreltin. OD₆₂₀ 0.4-0.8'e ulaşana kadar bakterileri kültürleyin.
      NOT: 0.1'lik bir OD₆₂₀ genellikle 3.0 x 10⁷ koloni oluşturan birime (CFU)/mL S. aureus'a karşılık gelir. Orta logaritmik büyüme fazındaki bir bakteri aşısının OD_620'si 0.4-0.8 arasındadır. Diğer bakteri türleri ve suşları için kültürleme için farklı zaman dilimlerine ihtiyaç duyulabilir.
2. Bakterileri 10 dakika boyunca 3.500 x g'da santrifüjleyin ve peletlenmiş bakterileri 1 mL steril PBS içinde yeniden süspanse edin. Daha sonra, bakterileri 2 kez steril PBS ile yıkayın ve son olarak bakterileri PBS'de 1.1 mL% 4 (a / h) polivinilpirolidon40 (PVP40) çözeltisinde yeniden süspanse edin.
3. Bu bakteri süspansiyonunu vorteksleyin ve OD 620 ölçümü için bir küvette 100 μL süspansiyonu₉₀₀ μL steril PBS içinde seyreltin. Bakteri süspansiyonunun konsantrasyonunu PVP40 çözeltisi ile ayarlayın. Bu, "Yalnızca bakteri" süspansiyonudur.
4. Biyomalzemeler, bakteri süspansiyonu ile karıştırılmak üzere serbestçe seçilebilir. Bu çalışmada ticari polistiren (PS) mikroküreler (mavi floresan, 10 μm) kullanılmıştır. Bir bakteri-Mikroküre süspansiyonu oluşturmak için, mikroküreleri 1.000 x g, oda sıcaklığında 1 dakika santrifüjleyin, süpernatanı atın ve mikroküreleri "Yalnızca Bakteri" süspansiyonunda (PVP40 çözeltisinde) yeniden süspanse edin.
5. Mikrokürelerin varlığında ve yokluğunda yaklaşık olarak eşit dozlarda bakteri enjekte etmek için, Bakteri-Mikroküre süspansiyonunun konsantrasyonunun "Yalnızca Bakteri" süspansiyonunun (mikroküreler olmadan) konsantrasyonunun üçte ikisi olması gerekir. Bu, Bakteri-Mikroküre süspansiyonunun 0,5 hacim PVP40 çözeltisi ile seyreltilmesiyle elde edilir. Süspansiyonları vorteksleyerek karıştırın. Dikkat çekici bir şekilde, bu oran (üçte iki) S. aureus için değerlendirilmiştir. S. epidermidis için de uygundur, ancak bu oranın diğer bakteri türleri ve enjekte edilecek diğer boyutlar (10 μm'den fazla) veya biyomalzeme şekilleri (mikrokürelerden daha fazla) için de geçerli olup olmadığının kontrol edilmesi tavsiye edilir.
6. "Sadece Bakteri" ve Bakteri-Mikroküre süspansiyonunun konsantrasyonunu aşağıdaki gibi 10 kat seri seyreltmelerin kantitatif kültürü ile kontrol edin: 100 μL süspansiyonu 96 oyuklu bir plakaya aktarın ve süspansiyonun 10 μL alikotlarını 90 μL steril PBS'ye aktararak seri olarak seyreltin. Agaroz plakaları üzerinde seyreltilmemiş ve seyreltilmiş süspansiyonların 10 μL alikotlarını plakalayın, plakaları gece boyunca 37 °C'de inkübe edin, kolonileri sayın ve bakteri sayısını hesaplayın (koloni oluşturan birimler, CFU).

2. Zebra Balığı Embriyolarının Yetiştirilmesi, Hasadı ve Bakımı

1. Aşağıda açıklanan değişikliklerle zebra balığı embriyolarının yetiştirilmesi, toplanması ve bakımı için genel prosedürleri izleyin. Seçilen transgenik hattan (burada, Mpeg1: Kaede) vahşi tip Tupfel uzun yüzgeçli (TL) zebra balığı veya zebra balığı ailesini, yetişkin dişileri ışık yandıktan sonra yumurta üretmeye teşvik etmek için bir ağ eklenmiş bir tankta çaprazlayın, ardından yetişkinleri üretilen yumurtalardan ayırın.
2. Ertesi gün embriyoları toplayın ve canlı olmayan şeffaf olmayanları atın. Petri kabı başına (100 mm çapında) yaklaşık 60 embriyoyu E3 ortamında tutun ve 28 °C'de inkübe edin. Ölü ve anormal embriyoları çıkarın ve E3 ortamını günlük olarak yenileyin.

3. Enjeksiyon İğnelerinin Hazırlanması

1. Bir mikropipet çektirme aleti kullanarak cam mikrokılcal iğneleri enjeksiyona hazırlayın. Aşağıdaki ayarları kullanın: ısı: 772, çekme: 100, vel: 200, süre: 40, gaz: 75.
2. İğne ucunu, iğnenin dış çapının yaklaşık 20 μm olduğu pozisyonda (10 μm mikroküreler için), okülerde bir ölçek çubuğu bulunan bir ışık mikroskobu kullanarak forseps ile kırın. Embriyoların hayatta kalmasını tehlikeye atacakları için çok büyük açıklık boyutuna sahip iğnelerden kaçının.
   NOT: Açıklık, enjekte edilecek biyomateryallerin boyutuna ve şekline bağlı olarak daha küçük veya daha büyük olacak şekilde seçilebilir. Literatürde yaklaşık 50 μm açıklığa sahip iğneler kullanılarak yapılan enjeksiyonların embriyo sağkalımında önemli bir azalmaya neden olduğu bildirilmiştir.

4. Zebra Balığı Embriyolarına Sadece Bakteri veya Bakteri Mikroküre Süspansiyonunun Enjeksiyonu

1. Agaroz çözeltisini ısıtın (%1–1.5 (ağırlıkça)) yarı suda) bir mikrodalga fırın kullanarak ve 100 mm'lik bir Petri kabına dökün. Embriyoları uygun pozisyonlara yerleştirmek ve enjeksiyonları kolaylaştırmak için agarozda girintiler oluşturmak üzere Petri kabındaki agaroz çözeltisinin üzerine plastik bir kalıp şablonu yerleştirin. Oda sıcaklığında inkübe edin ve agaroz çözeltisi katılaştığında kalıbı çıkarın.
2. Döllenmeden 3 gün sonra, embriyoları uyuşturmak için %0.02 (a/h) 3-aminobenzoik asit (Trikain) içeren 100 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin. 5 dakika sonra, embriyoları %0.02 (a/h) Trikain içeren E3 ortamı ile kaplanmış agaroz plakasına aktarın ve enjeksiyon için tek yönde hizalayın. Mpeg1 için: Kaede transgenik hattı önce embriyoları %0,02 (a/h) trikain içeren E3 ortamında uyuşturur. Ardından, bir stereo floresan mikroskobu kullanarak yeşil floresan proteinleri eksprese eden embriyoları seçin.
3. Bir mikro yükleyici pipet ucu kullanarak iğneyi yaklaşık 10 μL "Yalnızca Bakteri" veya Bakteri-Mikroküre süspansiyonu ile yükleyin. İğneyi mikro enjektöre bağlı bir mikromanipülatöre monte edin. Burada kullanılan enjektör için (Malzeme Tablosuna bakın), 2–3 nL'lik enjeksiyonlar için aşağıdaki ayarları kullanın: basınç: 300–350, karşı basınç: 0, süre: 2 ms. NOT: Mikro enjektörün ayarları kullanılan enjektöre bağlıdır. Enjektör ayarlarının, diğer şekil veya boyutlardaki biyomalzemelerle karıştırılmış bakteri enjeksiyonları için ayarlanması gerekebilir.
   1. "Yalnızca bakteri" süspansiyonu ve Bakteri-Mikroküre süspansiyonunun enjeksiyonu için aynı açıklığa sahip iğneler kullanın. İğne kırılmış veya tıkanmışsa, daha sonraki enjeksiyonlar için daima yeni bir iğne ile değiştirin.
4. İğneyi, ışık mikroskobu altında embriyoların kas dokusuna (Şekil 1), iğne ile embriyoların gövdesi arasında 45-60°'lik bir açıyla yerleştirin. İğnenin dokudaki konumunu hafifçe ileri geri hareket ettirerek ayarlayın. Mikro enjektöre bağlı bir ayak pedalı kullanarak embriyoları enjekte edin.
5. Floresan bakteri enjeksiyonundan sonra, embriyoları stereo floresan mikroskobu altında başarılı enfeksiyon için puanlayın. Negatif puan alan embriyoları atın (görünür floresan bakteri yok veya görünür floresan mikroküreler yok). Embriyoları 48 oyuklu plakalarda E3 ortamında ayrı ayrı tutun. Ortamı günlük olarak yenileyin.

5. Embriyoların Ezilmesi, Mikroskobik Puanlama ve Kantitatif Bakteri Kültürü

1. Enjeksiyonlardan hemen sonra başlayarak ve embriyolar kantitatif kültür için rastgele seçilene kadar sonraki her gün bir stereo floresan mikroskobu kullanarak tüm embriyoları floresan bakterilerin varlığı açısından mikroskobik olarak puanlayın.
2. Enjeksiyondan kısa bir süre sonra rastgele birkaç canlı enfekte embriyo (bu çalışmada 5 ila 6) seçin ve steril uçlar kullanarak 2 mL'lik mikrotüpleri ayırmak için ayrı ayrı aktarın. Ortamı çıkarın, embriyoları steril PBS ile bir kez nazikçe yıkayın ve 100 μL steril PBS ekleyin.
3. Her şişeye 2-3 steril zirkonya boncuk (2 mm çapında) ekleyin ve embriyoları homojenizatör kullanarak ( Malzeme Tablosuna bakınız) 3.500 rpm'de 30 saniye boyunca ezin. Homojenatı adım 1.3'te açıklandığı gibi kantitatif olarak kültürleyin.
   NOT: Diğer homojenizatörler farklı ayarlar gerektirebilir.
4. Adım 5.3'e göre kantitatif kültür için enjeksiyondan sonraki günlerde rastgele birden fazla embriyo seçin.

Sonuçlar

Şekil 1: Zebra balığı embriyolarının kuyruk kasına Bakteri-Mikroküre süspansiyonunun birlikte enjeksiyonunun şematik prosedürü.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Triptik soya agarı	BD Difco	236950	AMC'de medya hazırlama birimi
Triptik soya suyu	BD Difco	211825
Polivinilpirolidon40	Uygulama	A2259.0250
10 μm çapında polistiren mikroküreler (mavi floresan)	Yaşam teknolojisi/ThemoFisher	F8829 Serisi
Cam mikrokılcal damar (1 mm dış çap x 0,78 mm iç çap)	Harvard Aparatı	30-0038
Mikropipet çektirme aleti	Sutter Enstrüman A.Ş.	Alevli p-97
Işık mikroskobu LM 20	Leica	BKH33 10450123
3-aminobenzoik asit (Trikain)	Sigma-Aldrich	E10521-50G
Agaroz Milletvekili	Roche	11388991001
Stereo floresan mikroskop LM80	Leica	MDG3610450126
Mikro yükleyici pipet uçları	Eppendorf Belediyesi	5242956.003
M10 standlı mikromanipülatör M3301	Dünya Hassas Aletler	00-42-101-0000
FemtoJet ekspres mikro enjektör	Eppendorf Belediyesi	5248ZO100329
Microtrube 2ml pp	Sarstedt	72.693.005
Zirkonya boncuklar	Biyo-bağlantı	11079124ZX
MagNA lyser	Roche	41416401
Kloramfenikol	Sigma-Aldrich	C0378 (İngilizce)
Gyrotory çalkalayıcı (bakteri üremesi için)	New Brunswick Bilimsel	G10
Zebra balığı kuluçka makinesi	VWR	Incu-line
Küvetler	DAĞLAMAK	759015
Merkezkaç	Hettich-Zentrifugen	ROTANTA 460R
Spektrometre	İlaç biyoteknoloji	Ultrospec®2000 Sürümü
Forseps	Sigma-Aldrich	F6521-1EA
48 kuyu plakası	Greiner biyo-on	677180
96 kuyu plakası	Greiner biyo-on	655161
Petri kabı	Doğan	353003
Petri kabı	Biyomeriux	NL-132