Tek Hücreli Bakteri İnokulumunun Hazırlanması

Özet

Kaynak: Niu, L., ve diğerleri, Zebra Balığı Embriyolarında Mikobakteriyel Enfeksiyon Sırasında Makrofaj Litik Hücre Ölümünün İntravital Mikroskopi ile Görselleştirilmesi. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu video, enfeksiyon deneylerinde ve aşağı akış uygulamalarında tutarlı kullanım için bir geç log faz kültüründen bir Mycobacterium marinum tek hücreli süspansiyonun hazırlanmasını göstermektedir.

Protokol

1. Mycobacterium marinum Tek Hücreli İnokulum Preparatı (Şekil 1)

1. Gök mavisi-floresan Mycobacterium marinum gliserol stoğunu -80 °C'den çözün ve 7H10 agar plakasını %10 (h/h) OADC (oleik asit, albümin, dekstroz, katalaz), %0.25 gliserol ve 50 μg/mL higromisin ile aşılayın. Plakayı 32 °C'de yaklaşık 10 gün inkübe edin.
2. Pozitif floresan eksprese eden bir koloni seçin ve 3 mL 7H9 ortamını %10 OADC, %0.5 gliserol ve 50 μg/mL higromisin ile aşılayın.
   1. Aşılamayı, kültür logaritmik faza (OD₆₀₀ = 0.6–1.0) ulaşana kadar 4-6 gün boyunca 32 °C'de ve dakikada 100 devirde (rpm) inkübe edin.
   2. OD 600 ~1.0'a ulaşana kadar %10 OADC, %0.5 gliserol, %0.05 Tween-80 ve 50 μg/mL ile 30 mL taze 7H9 ortamında alt kültür (1:₁₀₀ ).
      NOT: Bu noktada en yüksek kültür kalitesi için bir alt kültür adımı önerilmektedir. Deneyimlerimize göre, klonu doğrudan büyük hacimli bir ortama eklemek, bakteri kümelerinin oluşumuna yol açacaktır.
3. M. marinum hücrelerini aşağıda açıklandığı gibi toplayın.
   1. M. marinum'u pelet olarak toplamak için 10 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatantın 300 μL'si hariç hepsini atın ve peleti yeniden süspanse etmek için kullanın.
   2. Peleti daha fazla süspanse etmek için% 10 gliserol ile 3 mL 7H9 ortamı ekleyin, ardından süspansiyonu 100 W'ta 15 s AÇIK, 15 s KAPALI'da toplam 2 dakika boyunca sonikleştirin.
      NOT: Sonikasyon, mikroenjeksiyon iğnesinin bloke edilmesini önleyen aşı için tek hücreli bir homojenat elde etmek için kullanılır.
4. Bakteri süspansiyonunu 10 mL'lik bir şırıngaya aktarın ve kümeleri çıkarmak için 5 μm'lik bir filtreden geçirin.
5. Bir spektrofotometre kullanarak süspansiyonun optik yoğunluğunu (OD) ölçün ve %10 gliserol içeren 7H9 ortamı ile OD₆₀₀ = 1.0'a seyreltin. Süspansiyonu 10 μL'lik parçalara bölün ve ileride kullanmak üzere -80 °C dondurucuda saklayın.
6. İnokulumun bakteri konsantrasyonunu (cfu / mL), bakteri stoğunun seri seyreltilmesi ve %10 (h/h), %0.5 gliserol ve 50 μg/mL higromisin içeren 7H10 agar plakası üzerine kaplanması ile doğrulayın.

Sonuçlar

Şekil 1: Tek hücreli bakteri preparatının şematik diyagramı. Tek hücreli Cerulean-floresan Mycobacterium marinum stokları, tarif edilen işlemin ardından üretildi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
%0,05 Ara-80	Sigma	P1379
10 mL şırınga	Güneş Enerjisi	YA0552
%10 OADC	BD	211886
5 μm filtre	Küfür X	SLSV025LS
50 μl/ml higromisin	Sangon Biyoteknoloji	A600230
7sa10	BD	262710
7H9	BD	262310
Çevre Odası	Pecon	Sıcaklık kontrolü 37-2 dijital
Eppendorf mikro yükleyici	Eppendorf Belediyesi	No.5242956003
Gliserol	Sangon Biyoteknoloji	A100854
Kuvöz	Omurga	PH-140 (A)
Mikobakteri marinum			ATCC BAA-535
Sonikatör	SCICNTZ	JY92-IIDN
Spektrofotometre (OD600)	Eppendorf AG	22331 Hamburg