Sıçan Pulmoner Endotel Hücrelerinin Bakteriyel Enfeksiyonunu Takiben Sitotoksik Amiloidlerin Elde Edilmesi

Bu makalede

Özet

Kaynak: Balczon, R., ve diğerleri. Pulmoner Endotel Hücrelerinin Pseudomonas aeruginosa Tarafından Enfeksiyonunu Takiben Sitotoksik Amiloidleri Saptama Yöntemleri. J. Vis. Deneyim (2018)

Bu video, Pseudomonas aeruginosa enfeksiyonunu takiben pulmoner endotel hücrelerinden sitotoksik süpernatant üretme prosedürünü göstermektedir. Bakteriyel efektör proteinlerin konakçı hücre yapısını nasıl bozduğunu ve sitotoksik amiloid oligomerlerinin süpernatana salınmasını nasıl indüklediğini özetlemektedir.

Protokol

Sitotoksik Süpernatanların Üretimi:

Sıçan pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinin (PMVEC'ler) birincil kültürleri, Güney Alabama Üniversitesi Akciğer Biyolojisi Merkezi'ndeki Hücre Kültürü Çekirdek Tesisinden elde edildi.

Sitotoksik süpernatanların üretimi için, 2 x 10⁶ hücreyi ayrı ayrı 150 cm'lik tabaklara koyun ve birleşme sağlanana kadar 3-4 gün boyunca büyütün. Deney başına iki plaka kullanın.
Süpernatan üretmek için, 150 cm'lik iki PMVEC kabından birini fosfat tamponlu salinle yıkayın, tripsinize edin ve ardından hücreleri sayın. PMVEC'lerin diğer kabını Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ile yıkayın ve ardından 20:1 enfeksiyon çokluğunda (MOI) Pseudomonas aeruginosa'nın her iki suşu ile enfekte edin. Bu, aşağıdaki şekilde elde edilir:
1. P. aeruginosa için, OD₅₄₀ 0.25 = 2 x 10⁸ CFU/mL. Bu seyreltmeyi hazırlamak için 1 mL'lik tek kullanımlık küvete 1 mL HBSS ekleyin. Bir spektrofotometre kullanılarak ölçüldüğünde 0,25'lik bir OD₅₄₀ elde edilene kadar plakadan yeterince bakteri kazıyın. Bir sonraki adım, ne kadar bakteriye ihtiyaç duyulacağının hesaplanmasını sağlayacaktır.
2. Kültür kabındaki PMVEC'lerin sayısı belirlendikten sonra, PMVEC'leri içeren ikinci, tripsinize edilmemiş kültür kabına eklenecek uygun bakteri sayısını belirleyin. Örneğin, PMVEC'lerin kültür kabının 1.3 x 10⁷ hücre içerdiği belirlenirse, 1.3 x 10⁷ hücre x 20 bakteri/hücre x 1 mL/2 x 10⁸ CFU = 1.3 mL bakteri hazırlayın.
3. 1.3 mL bakteriyi HBSS'ye 20 mL'lik bir nihai hacme kadar seyreltin, böylece 150 cm'lik bir kabın tüm yüzeyi sıvı ile kaplanabilir, ardından seyreltilmiş bakterileri PMVEC plakasına ekleyin.
4. Bakterilerle aşılanmış PMVEC'leri 37 °C'de %5 CO₂inkübatöründe 4-5 saat inkübe edin, plaka mikroskobik olarak gözlemlendiğinde hücre tek tabakasında boşluklar oluştuğu görülene kadar (Uygun boşluk oluşumu seviyesi için Şekil 1'e bakın).
5. Süpernatanı toplayın, ardından hücresel kalıntıları gidermek için bir masa üstü santrifüjde 2.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin.
  Not: Bu adım için, parçalanmamış hücreleri ve büyük hücre parçalarını peletlemek için yeterli g kuvveti üretebilen herhangi bir masa üstü santrifüj kullanılabilir.
6. Süpernatanı, ucuna 0,2 μm filtre takılı bir şırıngaya dökün, ardından bakterileri uzaklaştırmak için süpernatanı filtreden geçirin.
7. Sitotoksisiteyi test etmek için steril süpernatantın bir alikotunu kullanın ve süpernatantın geri kalanını ileride kullanmak üzere -80 °C'de dondurun.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 1. P. aeruginosa aşılamasının PMVEC morfolojisi üzerine etkileri. PA103 suşunun eklenmesinden (A) önce ve (B)'den dört saat sonra PMVEC'lerin birleşik bir tek tabakası. Enfekte hücrelerdeki hücre tek tabakasında boşluklar aç...