Yöntem makalesi

Amaxa Nucleofector İnsan Sinir Kök Hücreler Transfecting

23.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/240

⸱

19 Temmuz 2007

 , 
1Department of Pathology, University of California, Irvine (UCI)

Bu makalede

Özet

Bir ilgi bir hücreye gen Tanıtımı in vivo fonksiyonu nedenlerine açıklık için güçlü bir yöntemdir. Bu protokol Amaxa tarafından yapılan Nucleofector elektroporasyon cihazları kullanırken insan nöral kök / prekürsör hücrelerinin (hNSPCs) bir kültür transfecting verimli bir yöntem açıklanır.

Özet

Yaygın olarak kullanılan katyonik lipid transfeksiyon ayıraçları ile insan sinir kök / prekürsör hücrelerinin (hNSPCs) gibi birincil memeli sinir hücreleri, Transfeksiyon genellikle kötü hücre canlılığı ve düşük transfeksiyon verimliliği sonuçlandı. Böyle bir gen tabancası veya mikroenjeksiyon gibi ilgi bir gen, tanıtan diğer mekanik yöntemler de kötü hücre canlılığı ve transfekte hücreleri düşük numaraları ile sınırlıdır. Birincil hücre içine dışsal bir gen tanıtmak için viral yapıları kullanarak strateji viral vektörler ve potansiyel güvenlik endişeleri oluşturmak için gerekli zaman ve emek miktarı hem de kısıtlı olmuştur. Biz burada, nöral kök hücreler transfecting için özel olarak optimize edilmiş elektrik akımı parametreleri ve tampon çözeltiler Amaxa Nucleofector cihaz ve teknoloji kullanarak hNSPCs transfecting için bir adım-adım protokolünü açıklar. Bu protokolü kullanarak, biz, yaklaşık% 35 ilk transfeksiyon verimlilik elde etti ve istikrarlı bir transfeksiyon sonra% 70 ~. Protokol Nucleofector cihaz ile elektroporasyon uygun tampon transfekte DNA ile hNSPCs yüksek sayıda birleştirerek gerektirir.

Protokol

Not: Pasajlanması İnsan Nöral Kök Hücreler makale (bakın https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 ) ve Sayım İnsan Nöral Kök Hücreler makale ( https://www.jove.com / index / Details.stp? ID = 262 hNSPCs tekrar süspansiyon ve saymak nasıl öğrenmek için).

Hazırlık

  1. Transfeksiyon için kullanılabilir hücreleri bol miktarda (her DNA için birkaç milyon hücreleri transfekte) olduğuna emin olun.
  2. Transfekte hücreler 10 mcg / ml insan fibronektin transfeksiyon bir gece önce, seribaşı olacak içine Coat doku kültürü tabak,. Sağ transfeksiyon protokolü başlamadan önce, fibronektin kaldırmak, tabak PBS ile durulama ve çanak kültür ortamı. Ortamı ısıtmak için 37 ° C doku kültürü inkübatör çanak bırakın. Ayrıca, önceden sıcak 37 ° C inkübatör 1 ml kültür ortamı
  3. Transfekte DNA (ler), ve buz üzerinde transfeksiyon çözüm (Amaxa) yerleştirin.

Transfeksiyon

  1. PBS (genellikle x 106 hücre transfeksiyon başına ~ 5) hücreleri belirli bir sayıda yıkayın. Pelet santrifüjle (1000 rpm 5 dakika boyunca (~ 200xg)) hücreleri tarafından mümkün olduğu kadar çok PBS olarak kaldırmak ve 100 ul transfeksiyon kiti ile sağlanan transfeksiyon çözüm hücre pelletini tekrar süspansiyon haline getirin. Hücre süspansiyonu, 1.7 ml Eppendorf tüpüne aktarın.
  2. Hücre süspansiyonu ul DNA 5 (transfeksiyon ortalama DNA ~ 5-10 mg) ekleyin ve hafifçe karıştırın.
  3. Amaxa mini-pipet kullanarak, hücre DNA karışımı Amaxa transfeksiyon küvet içine aktarın. 1 ml, sonraki adım için önceden ısıtılmış kültür ortamı olduğundan emin olun. Ayrıca, inkübatör, hücre çanak kültür ortamı ile kaldırmak ve doku kültürü kaputu yerleştirin.
  4. Küvet Nucleofector koyun, tekerleği saat yönünde döndürmek ve programı "A-033" i seçin. Enter tuşuna basın.
  5. Başarılı bir transfeksiyon küvet çözüm üstünde kabarcıklar çok yoğun bir tabakanın varlığı ile gösterilir. Küvet içinde 500 ul sıcak medya ekleyin ve Amaxa mini-pipet kullanarak transfekte hücreler, önceden ısıtılmış medya ile çanak içine aktarın. Küvet daha sıcak bir ortam ile durulayın ve aynı bulaşık durulama ekleyin. 37 ° C doku kültürü inkübatör hücreleri ile çanak yerleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokol hNSPCs için oldukça hızlı ve verimli bir transfeksiyon prosedürü açıklamaktadır. Bu yordamı kullanarak, biz, yaklaşık% 35 ilk transfeksiyon verimlilik elde edilmiştir. Bu yordamı transfekte Hücreler bir seçim aracı stably transfekte nüfus üretmek için kullanılır ise kısa vadeli çalışmalar için (geçici olarak transfekte hücreler) ya da uzun vadeli çalışmalar için kullanılabilir. Biz eksojen protein ifade hücrelerin% 70 ~ hangi stabil transfekte hücreleri oluşturulur. Geçici transfekte hNSPCs, eksojen protein ~ 7 gün boyunca devam...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Teşekkürler

Yazarlar, Çocuk Hastanesi, Orange County hNSPC kültürleri Araştırma Enstitüsü Ulusal İnsan Nöral Kök Hücre Kaynak Dr. Philip H. Schwartz kabul etmek istiyorum.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Nucleofector CihazıAraçAmaxaAAD-1001
Fare nöral kök hücre nukleofektör kitiReaktifAmaxaVPG-1004

Kaynaklar

  1. Gresch, O., Engel, F. B., Nesic, D., Tran, T. T., England, H. M., Hickman, E. S., Krner, I., Gan, L., Chen, S., Castro-Obregon, S., Hammermann, R., Wolf, J., M ller-Hartmann, H., Nix, M., Siebenkotten, G., Kraus, G., Lun, K. New non-viral method for gene transfer into primary cells. Methods. 33, 151-163 (2004).
  2. Marchenko, S., Flanagan, L. A. Passaging Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 (2007).
  3. Marchenko, S., Flanagan, L. A. Counting Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262 (2007).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Elektroporasyon TransfeksiyonuH cre Transfeksiyon ProtokolN ral K k H cre TransfeksiyonuTransfeksiyon Verimlili iH cre Canl lDNA Vekt r TransfeksiyonuFare N ro K k H cre Sol syonuS cak Besiyeri ile Geri Kazan m

İlgili makaleler