$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
- Bakterilerin Enjeksiyon Yoluyla Bakteri Suşları ile Aşılanması
- Enjeksiyonların sabahı, test edilen bakteri suşlarının kriyovyallerini çıkarın ve 4 ° C'de 3-4 saat çözün. Enjekte edilecek her fare için 0,5 mL çözün. Çözüldükten sonra şişeleri buz üzerinde tutun ve farelere 2 saat içinde enjekte edin.
- Çözüldükten sonra, her bir kriyoviyal yeni bir 2 mL'lik tüpe aktarın ve 10 dakika boyunca 4.500 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı atın ve hücre peletini 1 mL 1x PBS (Fosfat tamponlu salin) içinde yeniden süspanse edin.
- 10 dakika boyunca 4.500 x g'da tekrar santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti 1x PBS'de 2.5 x 109 CFU/mL'lik bir nihai konsantrasyona (CFU: koloni oluşturan birimler) kadar yeniden süspanse edin. Kullanılan 1x PBS'nin tam miktarı, suşlar arasında biraz farklılık gösterecektir.
- Yukarıda açıklandığı gibi CFU/mL, genotip ve fenotipi doğrulamak için her suşun son süspansiyonundan 3 numune alın.
- Her suş için, tüpe girme sayısını sınırlamak için 5 fare başına 2 mL'lik bir tüpe 1.5 mL PBS/hücre süspansiyonu ayırın. Ayrıca, kontrol enjeksiyonları için 1x PBS tüpleri hazırlayın.
- Fareleri (bu deney için grup başına 10 erkek ve 10 dişi C57BL/6) ve enjeksiyonlar için gerekli malzemeleri (şırıngalar, iğneler, kesici alet kapları, işaretleyiciler, kalem ve kağıt vb.) toplayın. Steril hayvan ameliyathanesine geçin. Tüm yüzeyleri dezenfektan mendillerle silin.
- Deneycinin sıkıntısını ve yaralanma riskini ortadan kaldırmak için, ameliyathaneye aynı anda yalnızca bir cinsiyet ve deney grubu fare getirin (örneğin, belirli bir suşla enfekte olacak 10 erkek fareden oluşan bir grup). Isırıldığında eldivenlerin delinmesini önlemek için iki çift lateks eldiven giyin. Kontaminasyonu önlemek için laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve yüz maskesi takın.
- Kontrol grubunun enjeksiyonlarına 1x PBS ile başlayın. Bu, herhangi bir yan etkinin yalnızca enjeksiyondan kaynaklanıp kaynaklanmadığını belirleyecektir.
- Kafesten bir fare çıkarın. Bir seferde yalnızca bir fareyi kaldırın.
- Fareyi tartın ve enjeksiyon sonrası kilo kaybını izlemek için kuyruğunu kalıcı bir işaretleyici ile işaretleyin.
- Yeni bir 1 mL şırınga ve 27 G iğne açın (kontaminasyonu ortadan kaldırmak için her fare için yeni bir şırınga ve iğne kullanın) ve 200 μL steril 1x PBS enjekte edin.
- Başparmak ve işaret parmağını kullanarak fareyi kulaklarının arkasından tutun. Tutmak için ensede deri kıvrımı oluşturmak için sıkıştırın - daha sıkı bir kıvrım boyun hareketini ve enjeksiyon sırasında ısırılma riskini azaltır. Fareyi çok az hareketle düz tutmak için serçe parmağını kullanarak kuyruğu avuç içine sabitleyin.
- Fareyi ters çevirin ve iğneyi orta hattın sol veya sağ tarafındaki periton boşluğuna 30° açıyla sokun. Organlara değil intraperitoneal bölgeye yerleştirildiğinden emin olmak için iğneyi yerleştirdikten sonra hafifçe kaldırın. PBS'yi yavaşça enjekte edin ve ardından iğneyi geri çekin.
- Kullanılmış iğneyi belirlenmiş bir biyolojik tehlike kesici alet kabına yerleştirin. Şırıngayı veya iğneyi tekrar kullanmayın. Enjeksiyon bölgesinde bir bolus tipiktir.
- Enjeksiyondan sonra fareyi ayrı bir kafese taşıyın.
- Prosedürü bir sonraki fare ile tekrarlayın. Bir kafesin tüm farelerine enjekte edildikten sonra, onları hemen orijinal kafeslerine geri koyun.
- Kontrol grubunu enjekte ettikten sonra, aynı prosedürü izleyerek test edilecek suşların süspansiyonlarını enjekte etmeye başlayın.
- 200 μL hücre süspansiyonu enjekte edin. 2.5 x 109 CFU / mL'lik hücre süspansiyonları ile başlarken, her fare 5 x 108 CFU alır.
NOT: Bu konsantrasyonlar, her bir suşun öldürücü dozlarını belirlemek için ön hayvan araştırmaları ile optimize edildi. Dozlamanın diğer suşlar/türler için ayarlanması gerekebilir.
- Tüm enjeksiyonlar tamamlandıktan sonra, sıkıntıyı hafifletmek için fareleri barınma odasına geri koyun. Dezenfektan mendillerle çalışma alanını temizleyin.
- Ölü fareler için kafesleri 72 saat boyunca her 3 saatte bir ve 10 gün boyunca her 12 saatte bir kontrol ederek enjeksiyondan sonra hayvanları ölüm açısından izleyin. Hastalığa bağlı kilo kaybını belirlemek için farelerin ağırlığını her 12 saatte bir kaydedin.