Hedeflenen Gen Silme için Pseudomonas aeruginosa'nın Çift Çaprazlama Rekombinantlarının Üretilmesi

Özet

Kaynak: Valentine, M. E., ve diğerleri. Pseudomonas aeruginosa'da Çerçeve İçi Gen Silme Mutantlarının Üretilmesi ve Basit Bir Fare Enfeksiyon Modelinde Virülans Zayıflaması Testi. J. Vis. Uzm. (2020).

Bu video, plazmit bazlı bir gen silme stratejisi kullanılarak Pseudomonas aeruginosa'da çift çaprazlamalı rekombinantların üretimini göstermektedir. İşlem, tek bir çaprazlama yoluyla genoma entegre edilmiş replikatif olmayan bir plazmidi barındıran bakterilerin seçilmesini ve ardından plazmidi kesmek için sükroz seçimi altında ikinci bir rekombinasyon olayının indüklenmesini içerir. Başarılı çift çapraz rekombinasyon, antibiyotik direncinin kaybı ve sakaroz içeren ortamlarda büyüme yeteneği ile doğrulanır.

Protokol

1. P. aeruginosa'nın Çift Çapraz Rekombinantlarının Tespiti

1. Her et suyu kültürü için, 10 μL kültürü, %10 sükroz (gliserol içermeyen) ile desteklenmiş önceden ısıtılmış bir PIA (Pseudomonas Isolation Agar) plakasına aşılayın ve izole koloniler için çizgi çizin. Plakaları gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
2. Ertesi gün, plakaları inkübatörden çıkarın ve büyüme açısından inceleyin. Sükroza dirençli koloniler, çift çaprazlamalı rekombinantlar olmalıdır (yani, plazmit ekinin diğer homolog bölgesi ile P. aeruginosa kromozomu arasındaki bir rekombinasyon olayı yoluyla plazmidi kromozomdan çıkarmış olmalıdır).
   1. En az 20 koloniyi steril kürdan ile önceden ısıtılmış plakalara yerleştirin: 1) PIA, 2) %10 sükroz (gliserol içermeyen) ile desteklenmiş PIA ve 3) 300 μg/mL karbenisilin ile desteklenmiş PIA.
3. Plakaları gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
4. Plakaları inkübatörden çıkarın ve büyüme açısından inceleyin. Gerçek çift çaprazlama rekombinantları, karbenisiline duyarlı ve sükroza dirençli olacaktır (yani, sakaroz ile desteklenmiş PIA ve PIA üzerinde büyüyen, ancak karbenisilin ile desteklenmiş PIA üzerinde büyümeyen koloniler).

Malzemeler