Streptomyces venezuelae Sporlarının Sıvı Kültürden Hazırlanması ve İzolasyonu

Özet

Kaynak: Schlimpert, S., ve diğerleri. Mikroakışkan Bir Cihaz Kullanılarak Tüm S. venezuelae Yaşam Döngüsünün Floresan Hızlandırılmış Görüntülemesi. J. Vis. Uzm. (2016)

Bu video, Streptomyces venezuelae'den sporların yetiştirilmesini ve izolasyonunu göstermektedir. Bakterilerin stresten kurtulmasına yardımcı olan uyuyan hücreler olan sporlar, besin sınırlaması sırasında üretilir ve santrifüjleme yoluyla toplanır. Yöntem, sonraki uygulamalar için saf, soğukta saklanan bir spor süspansiyonu sağlar.

Protokol

1. Taze Streptomyces venezuelae Sporlarının İzolasyonu ve Kullanılmış Kültür Besiyerinin Hazırlanması

1. 60 ul R2 eser element çözeltisi (TE) ile desteklenmiş 30 ml Maltoz-Maya Ekstraktı-Malt Ekstraktı (MYM) ortamını, 10 ul SV60 suşu sporu ile aşılayın [attBφBT1::p SS209 (PdivIVA-divIVA-mcherry PftsZ-ftsZ-ypet)]. Hücrelerin tutarlı büyümesi ve sporlanması için, yeterli havalandırmaya izin vermek için şaşkın bir şişe veya yay içeren bir şişe kullanın.
2. 30 °C ve 250 rpm'de 35-40 saat kültür hücreleri.
3. Hücreleri sıvıya monte edilmiş faz kontrast mikroskobu ile inceleyin. Bu noktada misel parçaları ve sporları görünür olacaktır.
4. Miselyum ve daha büyük hücre parçalarını peletlemek için 1 ml hücreyi masa üstü bir santrifüjde 400 x g'da 1 dakika santrifüjleyin.
5. Bir spor süspansiyonu içeren yaklaşık 300 μl süpernatanı yeni bir 1.5 ml tüpe aktarın ve buz üzerinde tutun. Kalan kültür ortamını koruyun
6. Sporları MYM-TE içinde 1:20 oranında seyreltin (nihai konsantrasyon: 0,5-5 x 10⁷ spor/ml) ve ihtiyaç duyulana kadar buz üzerinde tutun.
   NOT: Streptomyces'te sporülasyonu tetikleyen kesin koşullar anlaşılmamış olsa da, sporlanan bir kültürden gelen bilinmeyen hücre dışı sinyaller de dahil olmak üzere kullanılmış MYM-TE ortamının kullanılması sporülasyonu uyarır.
7. Spor ve misel fragmanları içermeyen kullanılmış MYM-TE elde etmek için kalan kültür ortamının 10 ml'sini filtreleyerek sterilize edin. Steril 0,22 μm'lik bir şırınga filtresi kullanın ve kullanılmış MYM-TE'yi steril 15 ml'lik bir tüpe aktarın.
8. Benzer büyüme koşulları kullanılarak ek deneyler yapılacaksa, hazırlanan harcanan MYM-TE'yi birkaç gün 4 °C'de tutun.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Maltoz-Maya Ekspekt-Malt Ekstraktı (MYM)4 g Maltoz4 g Maya ekstraktı10 g Malt ekstraktı%50 musluk suyu ve %50 ters ozmoz suyu kullanarak 1 L H2O ekleyin ve otoklavlamadan sonra 100 ml'de 200 ml R2 eser element çözeltisi ile takviye edin			Streptomyces venezuelae SV60'ı kültürlemek için kullanılan sporülasyon ortamı
R2 Eser element çözeltisi (TE)8 mg ZnCl240 mg FeCl 3-6H2O2 mg CuCl2-2H 2O2 mg MnCl2-4H 2O2 mg Na2B4O7-10H 2O2 mg (NH4)6Mo7O24-4H 2Oadd 200 ml H2OAutoklav ve 4 °C'de saklayın			MYM'ye 0,002 birim ekleyin
PBS (fosfat tamponlu salin)	Sigma	P4417-100SEKME	Plakayı kısa süreli depolamaya hazırlamak için B04A plakalarındaki kullanılmayan şeritlerin giriş kuyularını doldurmak için kullanılır.
0,22 μm şırınga filtreleri	Satorius stedim	16532-K	Harcanan MYM-TE'nin hazırlanması