Streptomyces venezuelae Yaşam Döngüsünün Floresan Hızlandırılmış Görüntülemesi

Özet

Kaynak: Schlimpert, S. ve ark. Mikroakışkan Bir Cihaz Kullanılarak Tüm S. venezuelae Yaşam Döngüsünün Floresan Hızlandırılmış Görüntülemesi. J. Vis. Uzm. (2016)

Bu video, çimlenmeyi, hif büyümesini ve sporlanmayı gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için mikroakışkan bir cihaz kullanarak Streptomyces venezuelae bakterisinin tüm yaşam döngüsünün floresan hızlandırılmış görüntülemesini göstermektedir.

Protokol

1. Mikroskop ve Hızlandırılmış Protokolün Kurulumu

Not: Bu yöntem, bir sCMOS kamera, bir metal halojenür lamba, bir donanım otofokusu, 96 oyuklu plakalar için bir sahne tutucu ve bir çevre odası ile donatılmış, tamamen motorlu ve otomatik ters çevrilmiş bir geniş alan mikroskobunda uygulandı.

1. Deneye başladıktan sonra otomatik odaklama ile ilgili sorunları önlemek için ortam odasını önceden 30 °C'ye ısıtın. Gereken süre, kullanılan çevre odasına, mikroskoba ve ısıtma sistemine bağlıdır. Deneyden önceki gece sistemi ısıtmaya başlayın.
2. Mikroskobu ve mikroskopi otomasyon ve kontrol yazılımını açın. Optimum sinyal toplama ve uzamsal çözünürlük için 100X, 1,46 NA yağ DIC hedefi gibi yüksek sayısal açıklıklı (NA) bir yağa daldırma hedefi kullanın. Diferansiyel girişim kontrastı (DIC) görüntülerini ve sarı-floresan ve kırmızı-floresan protein füzyonlarının görüntülerini elde etmek için uygun filtreleri ve dikromatik aynaları seçin.
3. Objektifin üzerine bir damla daldırma yağı damlatın ve görüntü elde etme sırasında hücre odağını iyileştirmek için mikroakışkan plaka üzerindeki görüntüleme penceresinin altına daldırma sıvısı ekleyin. Kapalı mikroakışkan cihazı ters çevrilmiş mikroskobun tablasına dikkatlice monte edin. Plakanın tabla tutucusuna güvenli bir şekilde yerleştirildiğinden ve deney boyunca kaymadığından emin olun.
4. Yönlendirme için gömülü konum işaretleyicilerini kullanarak mikroakışkan kültür odasının görüntüleme penceresini odak noktasına getirin. 0,7 μm'lik bir tuzak yüksekliğine karşılık gelen tuzak boyutu 5 olan ilk akış odasının ("A" etiketli) en sol kısmına odaklanın.
5. Mikroakışkanlar yazılımında, hücreleri giriş kuyusu 8'den 4 psi'de 15 saniye boyunca yükleyin. Sahneyi görüntüleme penceresi boyunca hareket ettirerek kültür odasındaki hücre yoğunluğunu kontrol edin. Hiçbir spor yakalanmadıysa, hücre yükleme adımını tekrarlayın veya alternatif olarak istenen hücre yoğunluğu elde edilene kadar yükleme basıncını ve/veya süresini artırın (2.048 x 2.048 piksel ile görüntüleme penceresi başına 1-10 spor). Kültür odasını aşırı yüklemekten kaçının. Not: Streptomyces'i görüntülemek için normalde tuzak boyutu 5'i kullanırız, ancak tuzak boyutları 4 ve 3 ile de iyi sonuçlar elde ettik.
6. Kontrol yazılımında akış programını başlatın ve görüntü almaya başlamadan önce mikroakışkan plakanın mikroskop aşamasında 1 saat boyunca ısıyla dengelenmesine izin verin.
7. Mikroskop kontrol yazılımında, zaman içinde birden çok aşama konumunda birden çok görüntü almak için çok boyutlu bir çekim ayarlayın:
   1. Otomatik kaydetme için: görüntü dosyalarının otomatik olarak kaydedilmesi için bir dizin belirtin.
   2. Aydınlatma ayarları için, her bir yapı için en uygun aydınlatma ayarlarını önceden belirleyin. Ana hatlarıyla belirtilen deney için aşağıdaki maruz kalma sürelerini kullanın: DIC 150 msn, YFP 250 msn, RFP 100 msn.
   3. Zaman Serisi için: İstenilen zaman noktalarında görüntüleri sırayla elde etmek için bir zaman serisi ayarlayın. S. venezuelae'nin yaşam döngüsünü görüntülemek için 24 saatlik bir süre boyunca 40 dakikalık bir zaman aralığı seçin.
   4. Sahne konumları ve otomatik odaklama için: Sahne alanını hareket ettirerek kültür odasını tarayın ve ilgilenilen her görüntüleme konumu için sahne konumlarını kaydedin. Fotoağartma ve fototoksisiteyi en aza indirmek için tek aşamalı konumların yeterince ayrı yerleştirildiğinden emin olun. Tipik olarak, en fazla 12 konum kullanın. Yavaş odak kaymasını düzeltmek için her zaman noktası için otomatik odaklama rutinini çalıştırın. Mikroskop kontrol yazılımında varsa, otomatik odaklama stratejisini "donanım otomatik odaklama ile yerel yüzey güncellemesi" olarak ayarlayın. Seçilen sahne konumlarının Z koordinatları doğrulandıktan sonra, donanım otomatik odaklamasını etkinleştirin.
8. Mikroskop kontrol yazılımında hızlandırılmış deneyi başlatın.
9. Daha sonraki noktalarda tüm sahne konumlarının hala odakta olup olmadığını kontrol edin. Birkaç saatten fazla süren hızlandırılmış deneylerde, otomatik odaklama kullanırken bile ara sıra bir sahne kayması gözlemliyoruz. Tabla konumlarının yeniden odaklanması gerekiyorsa, deneyi uygun bir zaman noktasında durdurun, odağı ayarlayın ve tanımlanan görüntüleme zaman aralığı içinde deneyi yeniden başlatın.
10. 24-30 saat sonra veya ilgilenilen bölgedeki hifler sporlara farklılaştığında görüntü alımını durdurun. Daha sonra yazılımdaki akış programını durdurun ve mikroakışkan cihazı sökün.
11. Kısa süreli depolama için kullanılmış mikroakışkan plakayı hazırlayın. Kalan medyayı kuyu 1'den 6'ya kadar çıkarın, atık kuyusunu 7 ve hücre yükleme kuyusunu 8 boşaltın. Steril koşullar altında, plaka üzerindeki "A" şeridindeki kullanılmış kuyucukları ve kullanılmayan şeritlerdeki ("B" ila "D") kuyuları steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile yeniden doldurun. Kurumasını önlemek için plakayı parafilm ile kapatın ve 4 °C'de saklayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Bakteri hücreleri için B04A CellAsic ONIX plakası	Merck-Millipore	B04A-03-5PK	Mikroakışkan kültür plakaları
CellAsic ONIX Mikroakışkan Perfüzyon Sistemi ve ONIX FG (sürüm 5.0.2)	Merck-Millipore	EV-262 Serisi	En son ONIX sürümü (Temmuz 2015) ve programın nasıl kullanılacağına ilişkin talimatlar burada bulunabilir: http://www.merckmillipore.com
Axio Observer.Z1 Mikroskop	Zeiss	431007-9902-000	Tam otomatik ve motorlu ters çevrilmiş geniş alan mikroskobu
Sıcaklık Modülü S1 ve Isıtma ünitesi XL S2 ile inkübatör XL multi S1	Zeiss	411857-9061-000	Mikroskobu çevreleyen çevre odası
Plan-Apochromat 100x/1.46 Yağ DIC objektif	Zeiss	420792-9800-000
Ocra FLASH 4 V2	Hamamatsu Fotonik K.K.	C11440-22CU
Aydınlatıcı HXP 120V	Zeiss	423013-9010-000
FL Filtre Seti 46 HE YFP vardiyasız	Zeiss	489046-9901-000	Floresan filtre seti, uyarma 500/25 nm, emisyon 535/30 nm
FL Filtre Seti 63 HE RFP vardiyasız	Zeiss	489063-0000-000	Floresan filtre seti, uyarma 572/25 nm, emisyon 629/30 nm
Çok kuyulu plakalar için montaj çerçevesi K-M	Zeiss	000000-1272-644	Mikroakışkan plaka için tabla tutucu
ZEN yanlısı 2012	Zeiss	410135-1002-120	Mikroskop kontrol yazılımı
ZEN Modülü Hızlandırılmış Çekim	Zeiss	410136-1031-110	Hızlandırılmış mikroskopi deneylerini ayarlamak için yazılım modülü
ZEN Modül Karoları/Konumları	Zeiss	410136-1025-110	Belirli sahne konumlarını kaydetmek için yazılım modülü (xzy)
Fiji	Açık kaynaklı yazılım paketi	http://fiji.sc/Fiji	Zaman atlamalı filmlerin oluşturulması
PBS (fosfat tamponlu salin)	Sigma	P4417-100SEKME	Plakayı kısa süreli depolamaya hazırlamak için B04A plakalarındaki kullanılmayan şeritlerin giriş kuyularını doldurmak için kullanılır.
SV60 Serisi	John Innes Center suş koleksiyonu		S. venezuelae divIVA-mcherry ve ftsZ-ypet'i eksprese eden suşu