Pseudomonas aeruginosa'nın Antibiyotik Stresi Altında Oğul Verme Davranışı

Özet

Kaynak: Bru, J., ve diğerleri, Bakteri Sürülerinin Hızlandırılmış Görüntülemesi ve Toplu Stres Tepkisi. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu video, bir agar plakası kurulumu ve hızlandırılmış görüntüleme kullanarak, merkezi bir kültürden bir antibiyotikle karıştırılmış aynı kültürü içeren uydu noktalarına doğru bakteri üremesini gözlemleyerek Pseudomonas aeruginosa'nın oğul verme davranışını analiz etme prosedürünü göstermektedir.

Protokol

1. P. aeruginosa'nın Büyümesi ve Kaplama Koşulları

1. 400 mL_{ddH 2}O'ya 10 g LB-Miller toz karışımı ekleyerek 400 mL lizojeni suyu (LB) hazırlayın. % 2 LB-agar Petri kapları için 8 g agar daha ekleyin. Sterilize etmek için otoklav.
2. 20 mL erimiş LB-agar ortamını 10 cm çapındaki Petri kaplarına dökün ve gece boyunca oda sıcaklığında katılaşmalarına izin verin. Sıvı ortamı oda sıcaklığında ve agar plakalarını 4 °C'de saklayın.
3. Çizgili P. aeruginosa , steril halkalar veya tahta çubuklar kullanılarak -80 °C'de saklanan donmuş bir stoktan bir LB-agar Petri kabı üzerinde. Petri kabını gece boyunca 37 °C'de baş aşağı inkübe edin. LB-agar plakasını 1 haftaya kadar 4 °C'de saklayın.
4. Petri kabından steril bir halka veya tahta çubukla tek bir koloni seçin, 2 mL LB ortamına aşılayın ve kültürü 100 rpm'ye ayarlanmış bir silindir tamburunda 37 ° C'de gece boyunca (16-18 saat) doygunluğa kadar inkübe edin.
5. Bir P20 pipet kullanarak adım 1.4'ten itibaren 5 μL gece kültürünü pipetleyin ve pipet ucuna lekelenme alanının 2,5 cm yukarısında bir açıyla (10-45°) yaklaşarak, ilk durağa kadar pipetleyin ve agara sadece sıvı damlası ile dokunun (Şekil 1B).
   1. Agara zarar verebileceğinden agara pipet ucuyla dokunmaktan kaçının. Noktayı farklı kaynayan agar plakaları arasında tutarlı bir şekilde konumlandırmak için bir şablon kullanın.
6. Antibiyotik tedavileri için, adım 1.4'ten 30 μL gece kültürü P. aeruginosa'yı 6 μL 3 mg / mL gentamisin, 10 μL 100 mg / mL kanamisin veya 7.5 μL 100 mg / mL fosfomisin ile karıştırın. Hemen bir sonraki adıma geçin.
   1. Bir P20 pipet kullanarak 6 μL antibiyotikle işlenmiş P. aeruginosa'yı pipetleyin ve pipet ucuna lekelenme alanının 2,5 cm yukarısında bir açıyla (10 ila 45°) yaklaşarak çanağın merkezi etrafında 2,8 cm yarıçaplı eşmerkezli bir daire üzerinde 6 eşit uzaklıktaki uydu konumunda noktalayın, ilk durağa kadar pipetleyin, ve agara sadece sıvı damlası ile dokunmak (Şekil 1D).
   2. Agara pipet ucuyla dokunmaktan kaçının, çünkü bu ona zarar verebilir. Tutarlılık için bir kaplama şablonu kullanın.
7. Şeffaf Petri kabı kapaklarını siyah kapaklarla değiştirin (Şekil 2A).
8. Kaynayan agar plakalarını, %75 nemi korumak için 10 L su banyosu ile 37 °C'ye ayarlanmış bir inkübatördeki bir tarayıcıya yerleştirin (Şekil 1E, Şekil 2B). DİKKAT: Kaynayan agar plakalarındaki benekli hücreleri rahatsız etmeyin. Plakaları her zaman yukarı bakacak şekilde tutun.

Sonuçlar

Şekil 1: P . aeruginosa sürü tahlilinin şeması ve toplu stres tepkisi. (A) P. aeruginosa hücreleri, 37 ° C'de LB suyunda gece boyunca (yaklaşık 1.5'lik OD_600'e 16-18...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reaktif
Bacto agar, susuz	BD Difco	214010	LB-agar plakası ve kaynayan agar plakası için
Casamino asitler	BD Difco	223050	Kaynaştırma ortamı için
D-Glikoz	Fisher Kimyasal	D16500 Serisi	Dekstroz. Kaynaştırma ortamı için
Fosfomisin disodyum tuzu	Tokyo Kimya Endüstrisi	F0889 Serisi	Stok konsantrasyonu: 200 mg / mL. ddH₂O içinde çözünmüş
Gentamisin sülfat	Sigma-Aldrich	G1914 Serisi	Stok konsantrasyonu: 3 mg / mL. ddH₂O içinde çözünmüş
Kanamisin sülfat	Sigma-Aldrich	60615	Stok konsantrasyonu: 100 mg / mL. ddH₂O içinde çözünmüş
LB-Değirmenci	BD Difco	244620	LB et suyu ve LB-agar plakaları için
Magnezyum sülfat heptahidrat	Sigma-Aldrich	230391	Kaynaştırma ortamı için
Suş
Pseudomonas aeruginosa	Siryaporn laboratuvarı	AFS27E.118	PA14 suşu
Malzemeleri
Alüminyum oksit zımpara kağıdı	3 milyon	150 İyi	Siyah kapaklar için
Siyah kumaş	Joann'ın	PRD7089	Siyah kumaş
Siyah sprey boya	Krylon	5592 Mat Siyah	Siyah kapaklar için
Erlenmeyer şişesi	Kimax	26500	250 mL
Cam saklama şişeleri	Borcam	13951L	250 mL, 500 mL, 1000 mL
8 inç fermuarlı bağlar	Gardner Bükücü	E173770	Siyah mat kumaşı takmak için
Petri kapları (100 mm x 15 mm)	Balıkçı	FB0875712	100 x 15 mm polistiren plakalar
Tahta çubuklar	Balıkçı	23-400-102	Bakterileri çizmek ve aşılamak için
Ekipman
Otoklav	Pazar Forge Endüstrileri	STM-E	Reaktifleri sterilize etmek için
25 mL pipet	ABD Bilimsel, Inc.	1072-5410	Agar plakalarının kaynaşması için 20 mL'yi pipetlemek için
Nem alıcı	Frigidaire	FAD704DWD 70 pint	Oda bağıl nemini yaklaşık %45'te tutmak için
Kuvöz	VWR	89032-092	37 °C'de bakteri üremesi için
Isotemp su banyosu	Balıkçı	15-462-21Ç	Ortamı 55 °C'ye soğutmak için
Laminer akış başlığı	Fırıncı Şirketi	SG603A	Plakaları kurutmak için
P-20 pipet	Gilson'ın	F123601	Kaynayan agar plakalarında lekelenme
Pipet Denetleyicisi	Marka Teknolojisi	Akü-jet	Agar plakalarının kaynaşması için 20 mL'yi pipetlemek için