Vibrio parahaemolyticus'un Sürü Hücrelerine Farklılaşmasının İndüksiyonu

Özet

Kaynak: Heering, J., ve diğerleri. Hücresel Farklılaşmanın İndüksiyonu ve Vibrio parahaemolyticus Yüzücü ve Sürü Hücrelerinin Tek Hücre Görüntülemesi. J. Vis. Uzm. (2017)

Bu video, özel olarak hazırlanmış bir agar ortamı kullanılarak Vibrio parahaemolyticus'ta sürü hücre farklılaşmasının indüklenmesini göstermektedir. Demir tükenmesi, kalsiyum takviyesi ve yüzey teması gibi çevresel ipuçlarını manipüle ederek, bakteriler yüzücü formlarından lateral flagellalı uzun sürü hücrelerine geçiş için uyarılır. Bu farklılaşmış hücreler katı yüzey boyunca yayılarak başarılı morfolojik değişimi simgeleyen karakteristik sürü parlamaları oluşturur.

Protokol

1. Sürü Hücre Farklılaşmasının İndüksiyonu

NOT: Aşağıdaki adımlar, V. parahaemolyticus'un sürü hücre yaşam döngüsüne farklılaşmasının nasıl indükleneceğini ve katı yüzeylerde proliferasyonun nasıl uyarılacağını açıklamaktadır.

1. Kaynaşma plakalarını hazırlamak için 4 g Kalp İnfüzyonu (HI) Agar'ı 100 mL ddH₂O'da süspanse edin.

2. HI agar çözeltisini mikrodalgada dikkatlice kaynatın ve toz eriyene kadar şişeyi zaman zaman sallayın. 121 °C'de 20 dakika otoklavlayın.

3. Otoklavlamadan sonra HI agarı 60-65 dereceye soğutun. 50 μM'lik bir nihai konsantrasyona (%100 etanol içinde 50 mM'lik stok çözeltisi) 2,2'-Bipiridil ekleyin. CaCl_{ekleyin 2} 4 mM'lik bir nihai konsantrasyona (ddH₂O içinde 4 M'lik stok çözeltisi). Gerekirse, plazmitleri korumak için çözeltiye antibiyotik ekleyin.

NOT: İndüklenebilir bir plazmit kullanmayı planlıyorsanız, nihai konsantrasyonuna bir indükleyici ajan ekleyin.

DİKKAT: 2,2'-Bipiridil: Akut toksisite (oral, dermal, inhalasyon). Bu kimyasalı kullanırken eldiven ve koruyucu gözlük kullanın.

4. 30 - 35 mL nihai HI agar çözeltisini 150 mm'lik yuvarlak bir Petri kabına dökün ve agarın katılaşmasına izin verin.

5. Hücre kültürünü tespit etmeden hemen önce, agar plakasını 37 °C'de en az 10 dakika (veya herhangi bir sıvı kalıntısı kaybolana kadar, ancak artık kaybolmayana) açık bir kapakla dik olarak kurutun.
NOT: Kuruma süreleri büyük ölçüde kullanılan inkübatöre bağlıdır ve yoğun şekilde kurutulmuş plakalar V. parahaemolyticus'un kaynaşmasına izin vermez. (Bu adım çok önemlidir!) Plakalar taze kullanılmalı ve 2 - 3 saatten eski olmamalıdır. Eski plakalar oğul vermeyi teşvik edemeyecek kadar kuru olacaktır.

6. Tek bir koloninin kenarından az miktarda hücreyi 5 mL Luria-Bertani (LB) suyuna aşılayın. Kültürü OD₆₀₀ = 0.8'e ulaşılana kadar 37 °C'de çalkalayarak inkübe edin, genellikle yaklaşık 2-3 saat sürer. Bundan sonra, hücreler HI sürü agar plakalarına lekelenmeye hazırdır.

7. Bir HI agar sürü plakasının merkezine 1 μL hücre kültürü yerleştirin (Şekil 1A).

8. Lekenin kurumasını bekleyin (Şekil 1B).

9. Plakayı şeffaf plastik bantla kapatın ve sıkıca takıldığından emin olun, aksi takdirde gece inkübasyonu sırasında ayrılabilir (Şekil 1C).

NOT: Contanın mükemmel olması çok önemlidir. Uygulandığında bantta hava kabarcıkları ve kıvrımlar oluşmasını önleyin.

10. Plakayı gece boyunca 24 °C'de inkübe edin. Bu, bir V. parahaemolyticus sürü kolonisinin çevresinden uzanan sürü alevlenmeleri ile sürü kolonisi (Şekil 2).

Sonuçlar

Şekil 1: Swarmer farklılaşmasının indüksiyonu ve mikroskopi görüntüleme için hücrelerin hazırlanması. V. parahaemolyticus sürü hücrelerini üretmek için iş akışının basitleştirilmiş görselleştirilmesi ve tek sürü hücre...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Medya bileşenleri
LB orta	Roth	X968.3
Difco Agar, granül	BD	214510	LB besiyeri ile LB agarın hazırlanması için
Difco Kalp İnfüzyon Agarı	BD	244400	HI agar kaynaştırma plakalarının hazırlanması için
Agaroz NEEO, ultra kalite	Roth	2267.3	Mikroskopi agaroz pedlerinin hazırlanması için
Katkı madde -leri
2,2'-Bipiridil	Sigma Aldrich	D216305-25G	HI agar kaynaştırma plakalarının hazırlanması için
Kalsiyum klorür dihidrat	Roth	5239.1	HI agar kaynaştırma plakalarının hazırlanması için
Donanım
Petri kabı 150 mm x 20 mm kamlı	Sarstedt	82.1184.500	HI agar kaynaştırma plakalarının hazırlanması için
kelvitron t (B 6420)	Heraeus	-	HI agar kaynaştırma plakalarını kurutmak için kullanılır