Bitki Hücrelerinde Bakteriyel Enfeksiyon ve Efektör Protein Dağıtımının İzlenmesi

Özet

Kaynak: Lee, H. ve diğerleri, Enfeksiyon Sırasında Bakterilerden Verilen Efektörleri Görselleştirmek için Bölünmüş Yeşil Floresan Protein Sistemi. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu video, konfokal mikroskopi ile birlikte bölünmüş süper klasör yeşil floresan proteini (sfGFP) tamamlama kullanılarak bitki hücrelerinde bakteriyel enfeksiyonu ve efektör protein dağıtımını izlemek için bir yöntem göstermektedir. Yaklaşım, efektör translokasyonunun konakçı hücre sitozolüne hassas bir şekilde görselleştirilmesini sağlar.

Protokol

NOT: Aksi belirtilmedikçe tüm adımlar oda sıcaklığında gerçekleştirilir.

1. Bitkisel materyallerin hazırlanması (4 hafta)

1. Nicotiana benthamiana bitkileri için hazırlık
   1. Her saksının toprak yüzeyine 2 N. benthamiana tohumu ekin, tepsiyi plastik bir kubbe ile örtün ve tohumların 16/8 saatlik aydınlık/karanlık fotoperiyot döngüsüne sahip 25 °C, %60 nemli bir büyüme odasında çimlenmesine izin verin.
   2. İki hafta sonra, her saksıdaki en küçük fideyi seçin ve atın. Adım 1.1.1'de çimlenme için uygulananla aynı büyüme koşulları altında bitki yetiştirmeye devam edin. Her iki günde bir tepsi başına 1 L su ekleyin.
      NOT: Bitkilerin büyüme koşulları laboratuvarlar arasında farklılık gösterebilir. Bu nedenle bitkiyi sağlıklı bir durumda yetiştirmek için düzenli sulama protokolünü izleyin.
   3. Bir hafta içinde bitkileri yeni bir tepsiye aktarın ve daha fazla büyüme için yeterli alana yerleştirin. Bitkileri, 4 haftalıkken sızmaya hazır olana kadar adım 1.1.1'de açıklanan koşullar altında büyütmeye devam edin.
      NOT: Bitki büyümesi, laboratuvarlardaki büyüme koşullarına bağlı olarak farklılık gösterebilir. Genellikle 4 haftalık N. benthamiana bitkilerinin yaklaşık altı yaprak taşıdığını görürüz.
2. Arabidopsis thaliana transgenik bitkilerine hazırlık
   1. Malzeme Tablosuna bakın ve transgenik Arabidopsis tohumlarını sipariş edin.
   2. ~50 - 100 transgenik Arabidopsis tohumunu 1 mL damıtılmış suya batırın ve çimlenmenin başlangıcını senkronize etmek için karanlıkta 3 gün boyunca 4 °C'de saklayın.
   3. Bir tıkaç bitki tepsisinin toprak yüzeyine ~2 - 3 tohum ekin ve tepsiyi plastik bir kubbe ile örtün. Tohumların 23 °C'de, %60 nemde 10/14 saatlik aydınlık/karanlık fotoperiyot döngüsüyle çimlenmesine izin verin.
      NOT: Tohumlar homozigot olmalıdır. Bununla birlikte, partide transgenin varlığını yeniden doğrulamanızı öneririz. Bu durumda tohumları %70 etanol ile 2 dakika, %0,05 Triton X-100 içeren %50 ağartıcı (yaklaşık %2 hipoklorit) ile 5 dakika yıkayarak sterilize edin. Ardından steril çift damıtılmış su (ddH₂O) ile 5-6 kez yıkanır. Sterilizasyondan sonra, 3 gün boyunca 4 °C'de tabakalaştırın ve transgenik bitkileri seçmek için 25 μg/L higromisin B içeren bitki çimlenme ortamına koyun.
   4. Bir hafta sonra, tapa başına yalnızca bir bitki bırakın ve adım 1.2.3 için kullanılan aynı büyüme koşulları altında bitki yetiştirmeye devam edin.
      NOT: Pseudomonas syringae enfeksiyonu için dört haftalık bitkiler kullanıldı. Bitkileri sağlıklı tutmak için bitkileri gün aşırı sulayın.

2. Pseudomonas Kültürünün Hazırlanması (~1 Hafta)

1. Pseudomonas dönüşümü için plazmitin oluşturulması
   1. Malzeme Tablosuna bakın ve tip III sekresyon sistemi (T3SS) tabanlı efektör dağıtım sistemi vektörünün istenen vektör(ler)ini sipariş edin.
   2. İlgilenilen efektör geni, bölgeye özgü rekombinasyon klonlamasını kullanarak efektör dağıtım vektörüne yerleştirin.
      NOT: Tam uzunluktaki efektör proteinin hücre altı lokalizasyonunu izlerken, tam uzunluktaki geni pBK-GW-1-2 veya pBG-GW-1-2'ye koyun. Artan floresan sinyali için 2x sfGFP11 (sfGFP'nin 11. β dizisi) içeren pBK-GW-1-4 veya pBG-GW-1-4'ü seçmek de mümkündür. Sinyal peptidi olmayan kısmi efektör durumunda, pBK-GW-2-2 veya pBK-GW-2-4 kullanın.
2. SfGFP11 etiketine kaynaşmış bir efektör taşıyan plazmidi P. syringae pv'ye dönüştürün. Domates (Pst) standart elektroporasyon kullanılarak CUCPB5500.
   NOT: Gerekirse diğer Pseudomonas suşları kullanılabilir. sfGFP11 etiket sistemi, geniş bir vektör yelpazesi için oluşturulmuştur ve efektörün gen ekspresyonu, örneğin Pseudomonas fluorescens (EthAn) ile karşılaştırılabilir olan AvrRpm1 promotörü tarafından düzenlenir.
3. Dönüştürülmüş bakteri hücrelerini, 100 μg/mL rifampisin ve 25 μg/mL kanamisin veya 25 μg/mL gentamisin içeren King's B agar plakalarının yüzeyine nazikçe yayın. 28 °C'de 2 gün inkübe edin.
4. Bir koloniyi, kullanılan vektöre uygun antibiyotiklerle King's B sıvı ortamına aşılayın ve hücreleri gece boyunca 28 °C'de 200 rpm'de çalkalayarak büyütün.
5. Bir gliserol stoğu yapın. Otoklavlanmış gliserolü %50'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin ve -80 derecede saklayın.

3. N. benthamiana'da Organel hedefli sfGFP1-10^OPT'nin (sfGFP'nin 1-10. β ipliği) Geçici Ekspresyonu (4 Gün)

1. Agrobacterium kültürünün hazırlanması
   1. Organel hedefli sfGFP1-10^OPT plazmit(ler)inin istenen vektör(ler)ini sipariş edin ( Malzeme Tablosuna bakın).
   2. Plazmit(ler)i Agrobacterium tumefaciens suşu GV3101 hücrelerine dönüştürün. Hücreleri, 2 gün boyunca 28 ° C'de 50 μg / mL kanamisin ve 50 μg / mL rifampisin ile desteklenmiş Luria-Bertani (LB) agar ortamında büyütün.
   3. LB agar ortamındaki tek bir koloniden, hücreleri 50 μg/mL kanamisin ve 50 μg/mL rifampisin ile desteklenmiş 5 mL sıvı LB ortamına aşılayın. Hücreleri gece boyunca 28 °C'de 200 rpm'de çalkalayarak büyütün.
   4. Hücreleri 10 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüjleme ile hasat edin. Süpernatan ortamı dökün ve peleti 1 mL taze yapılmış infiltrasyon tamponunda yeniden süspanse edin.
   5. 600 nm (Abs 600 nm) absorbansta optik yoğunluk (OD) değerini elde ederek Agrobacterium miktarını ölçün. Bakterilerin OD_600'ünü infiltrasyon tamponu ile 0,5'e ayarlayın.
      NOT: İki noktaya sızmak için 1 mL süspansiyon yeterlidir.
   6. Sızmadan önce kültürü oda sıcaklığında 1-5 saat boyunca yumuşak bir sallanan sandalye üzerinde bırakın.
   7. 10 μL'lik bir uçla sızacak yaprakların ortasına bir delik açın. Agrobacterium süspansiyonlarına sızmak için 1 mL'lik iğnesiz bir şırınga kullanın. Adım 3.1.5'ten hazırlanan süspansiyonların yaklaşık 500 μL'sini şırınga aracılığıyla yaprağın adaksiyal tarafına dikkatlice ve yavaşça enjekte edin. Deneysel kopyalar için sızmayı en az üç farklı bitkide tekrarlayın.
      NOT: Sağlık ve güvenlik nedenleriyle, infiltrasyon sırasında göz koruması takılmalıdır.
   8. Yapraklarda kalan bakteri süspansiyonunu silin ve sızan bölgenin sınırını işaretleyin.
   9. Sızan bitkileri 2 gün boyunca adım 1.1.1 için kullanılan aynı büyüme koşulları altında tutun.

4. Pseudomonas'ın Aşılanması (4 Gün)

1. Adım 2.5'teki gliserol stoğundan dönüştürülmüş Pseudomonas suşunu King's B agar ortamında uygun antibiyotiklerle 28 ° C'de 2 gün boyunca çizin.
   NOT: Pseudomonas'ın sağlığı çok kritiktir. Koloniler iyi oluşmazsa, devam etmeden önce hücreleri tekrar çizin veya hücreleri King'in sıvı ortamında çoğaltın.
2. Bir döngü dolusu Pseudomonas hücresini Mannitol-Glutamat (MG) sıvı ortamında 28 °C'de gece boyunca 200 rpm'de çalkalayarak aşılayın.
3. Hücreleri 10 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüjleme ile hasat edin. Süpernatan ortamı dökün, peleti 10 mM MgCl_2'de yeniden süspanse edin ve OD_600'ü N. benthamiana yaprakları için 0,02'ye (1 x 10⁷ cfu / mL) ve Arabidopsis yaprakları için 0,002'ye (1 x 10⁶ cfu / mL) ayarlayın.
4. N. benthamiana için, Pseudomonas süspansiyonunu, sfGFP1-10^OPT yapısını taşıyan Agrobacterium'un 2 gün önce sızdığı yaprak alanına sızdırın (adım 3.1.7'de olduğu gibi). sfGFP1-10^OPT transgenik Arabidopsis için, Pseudomonas süspansiyonunu 4 haftalık iki kısa günlük yetişkin yaprağa sızdırın.
   NOT: Deneysel kopyalar için en az üç bitkiye ihtiyaç vardır.

5. Konfokal Mikroskopi ile sfGFP Sinyalinin Gözlemlenmesi (1 Gün)

1. Pseudomonas ile aşılanmış yapraklardan yaprak diskini kesin. Pseudomonas'ın sızmasından sonraki belirli zaman noktalarında, 40X/1.2 sayısal açıklık (NA) C-Apochromat suya daldırma objektifi veya 63X/^0.8 NA C-Apochromat yağa daldırma objektifi olan bir lazer taramalı konfokal sistem kullanarak tek bitkiden iki adet 2 cm2 yaprak diski görüntüleyin. Ölü hücrelerin yaralanma nedeniyle ölmesini önlemek için, hücreleri sızma deliğinden uzakta gözlemleyin.
2. Gözlemi 488 nm argon lazerin düşük güç ayarında başlatın. SfGFP'yi tespit etmek için lazer gücünü artırın.
   NOT: Floresan sinyalini tespit etmek için genellikle lazer yoğunluğunun %2 - 15'ini kullanırız. Ancak lazer gücü ve algılama ayarları kullanıcının mikroskopi sistemine göre ayarlanmalıdır. Burada emisyon filtreleri 520 - 550 nm'ye ayarlandı. Ölü hücreler genellikle 488 nm lazer uyarımı altında oto-floresan yayar. Bu nedenle, negatif bir kontrol olarak, sfGFP11 etiketi olmayan aynı efektöre sızılmalı ve aynı gözlem koşulları altında gözlemlenmelidir. Ek olarak, yüksek lazer uyarımı klorofil otofloresansını indükleyebilir. Bu nedenle, klorofil otofloresansını indüklememek için kontrol bitki hücrelerini kullanarak lazer yoğunluğunu ayarlayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Arabidopsis transgenik hatları			Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Pseudomonas syringae Efektörlerinin Tip III Sekresyon Yoluyla Uzay-Zamansal İzlemesi, Bölünmüş Floresan Protein Parçaları Kullanarak. Bitki Hücresi. 29 (7), 1571-1584 (2017)
SİTO-SFGFP1-10	ABRC	CS69831
NU-sfGFP1-10	ABRC	CS69832
PT-SFGFP1-10	ABRC	CS69833
MT-sfGFP1-10	ABRC	CS69834
PX-sfGFP1-10	ABRC	CS69835
ER-sfGFP1-10	ABRC	CS69836
GİT-SFGFP1-10	ABRC	CS69837
PM-sfGFP1-10	ABRC	CS69838
Organel hedefli sfGFP1-10OPT plazmidi			Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Pseudomonas syringae Efektörlerinin Tip III Sekresyon Yoluyla Uzay-Zamansal İzlemesi, Bölünmüş Floresan Protein Parçaları Kullanarak. Bitki Hücresi. 29 (7), 1571-1584 (2017)
SİTO-SFGFP1-10	Addgene	97387
NU-sfGFP1-10	Addgene	97388
PT-SFGFP1-10	Addgene	97389
MT-sfGFP1-10	Addgene	97390
PX-sfGFP1-10	Addgene	97391
ER-sfGFP1-10	Addgene	97392
GİT-SFGFP1-10	Addgene	97393
PM-sfGFP1-10	Addgene	97394
ER-sfKiraz1-10	Addgene	97403
ER-sfYFP1-10	Addgene	97404
SİTO-SFCFP1-10	Addgene	97405
T3SS tabanlı efektör dağıtım sistemi için sfGFP11 etiketli Ağ Geçidi uyumlu vektör	Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Pseudomonas syringae Efektörlerinin Tip III Sekresyon Yoluyla Uzay-Zamansal İzlemesi, Bölünmüş Floresan Protein Parçaları Kullanarak. Bitki Hücresi. 29 (7), 1571-1584 (2017)
pBK-GW-1-2	Addgene	98250	pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Kanamisine dayanıklı (25 ug/ml)
pBK-GW-1-4	Addgene	98251	pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Kanamisine dayanıklı (25 ug/ml)
pBK-GW-2-2	Addgene	98252	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Kanamisine dayanıklı (25 ug/ml)
pBK-GW-2-4	Addgene	98253	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Kanamisine dayanıklı (25 ug/ml)
pBG-GW-1-2	Addgene	98254	pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Gentamisin'e dayanıklı (25 ug/ml)
pBG-GW-1-4	Addgene	98255	pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Gentamisin'e dayanıklı (25 ug/ml)
pBG-GW-2-2	Addgene	98256	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Gentamisin'e dayanıklı (25 ug/ml)
pBG-GW-2-4	Addgene	98257	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Gentamisin'e dayanıklı (25 ug/ml)
Bakteri suşları
Agrobacterium tumefaciens GV3101			Csaba Koncz ve Jeff Schell, TL-DNA geni 5'in promotörü, yeni bir Agrobacterium ikili vektörü türü tarafından taşınan kimerik genlerin dokuya özgü ekspresyonunu kontrol eder. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Gentamisin (50 ug/ml) ve rifampisine (50 ug/ml) karşı dayanıklıdır
Pseudomonas syringae pv. Domates CUCPB5500			Kvitko, B. H. ve diğerleri. Pseudomonas syringae pv. domates DC3000 tip III sekresyon efektör genleri, efektörler arasında fonksiyonel örtüşmeyi ortaya koymaktadır. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Rifampisine dayanıklı (100 ug/ml)
Medya bileşenleri
Bitki çimlenme ortamı			Suya 2.165g/L Murashige & Skoog tozu, 10 g/L sükroz ekleyin. pH 5,8'e ayarlayın ve 2,2 g/L fitaj ekleyin. Otomatik buzağı.
Murashige & Skoog orta vitaminler dahil	Duchefa Biyokimyası	M0222 Serisi	4 °C'de saklayın.
Sakaroz	Duchefa Biyokimyası	S0809
Fitajel	Sigma-Aldrich	P8169
LB ortamı			Suya 10 g/L tripton, 5 g/L maya özütü, 10 g/L NaCl ekleyin. Katı ortam için 15 g/L mikro agar ekleyin. Otoklav. Çözeltinin 55 dereceye kadar soğumasını bekleyin ve gerekirse antibiyotik ekleyin.
Tripton	BD Biyobilim	211705
Maya özü	BD Biyobilim	212750
NaCl	Duchefa Biyokimyası	S0520 Serisi
Mikro agar	Duchefa Biyokimyası	M1002 Serisi
King's B medyası			10 g/L proteaz pepton #2, 1.5 g/L susuz K2HPO4, 15 g/L agar suya. Otoklav. 55 °C'ye soğutun ve ortama steril 15 ml/L gliserol, 5 ml/L MgSO4 ekleyin. Gerekirse antibiyotik ekleyin.
Proteoz pepton	BD Biyobilim	212120
Susuz K2HPO4	Sigma-Aldrich	1551128 USP
Gliserol	Duchefa Biyokimyası	G1345 Serisi
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506 Serisi
Bacto Agar	BD Biyobilim	214010
Mannitol-Glutamat (MG) sıvı ortam			Suya 10 g/L mannitol, 2 g/L L-glutamik asit, 0,5 g/L KH2PO4 , 0,2 g / L NaCl ve 0,2 g / L MgSO4 ekleyin . pH 7'ye ayarlayın
Mannitol	Duchefa Biyokimyası	M0803 Serisi
L-glutamik asit	Duchefa Biyokimyası	G0707 Serisi
KH2PO4	Sigma-Aldrich	NIST200B
Sızma tamponu			10 mM MES (2-(N-morfolino)-etan sülfonik asit), 10 mM MgCl2, 150 μM asetosiringon. pH 5.6; Kullanmadan önce yeni bir tampon hazırlayın.
MES	Duchefa Biyokimyası	M1503 Serisi	Suda 100 mM (pH 5.6) stok hazırlayın. Filtre sterilize edin.
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266 Serisi	Suda 100 mM stok hazırlayın. Otoklav.
Asetosiringon	Sigma-Aldrich	D134406	DMSO'da 150 mM stok hazırlayın.
Konfokal mikroskop ekipmanları/malzemeleri
710 lazer taramalı konfokal sistem	Carl Zeiss
Axio gözlemci Z1 ters mikroskop	Carl Zeiss