Işık desenli hidrojel bozunması kullanılarak hedeflenen bakteri kolonisi izolasyonu

Abstract

Kaynak: Fattahi, N., vd. Bakteri taraması, seçimi ve izolasyonu için ışıkla parçalanabilen hidrojel arayüzleri. J. Vis. Uzm. (2021).

Bu video, UV ışığı kullanılarak ışıkla parçalanabilen bir hidrojelden bakteri kolonilerinin ekstraksiyonunu göstermektedir. Belirli bir koloni seçilir ve lokalize hidrojel bozunmasını başlatmak için desenli bir ışığa maruz kalma tasarlanır. Işık yoğunluğunu ve süresini ayarladıktan sonra UV ışığı uygulanarak koloni serbest bırakılır. Koloni daha sonra borulardan aspire edilir ve aşağı akış analizi için bir tüpe aktarılır.

Protocol

1. Bakteri suşları ve kültür protokolleri

1. Uygun büyüme ortamı ile desteklenmiş agar plakaları üzerindeki bakteri kolonilerini çizin. Bu raporda, B. subtilis (suş 1A1135, Bacillus Genetik Stok Merkezi) ATGN (0.079 M KH₂PO₄ (Potasyum dihidrojen fosfat), 0.015 M (NH₄) ₂SO₄ (Amonyum sülfat), 0.6 mM MgSO₄·7H₂O (Magnezyum sülfat heptahidrat), 0.06 mM CaCl₂·2H₂O (Kalsiyum klorür dihidrat), 0.0071 mM MnSO₄·H₂O (Manganez(II) sülfat monohidrat), 0.125 M FeSO₄·7H₂O (Demir sülfat heptahidrat), 28 mM glikoz, pH: 7 ± 0.2, 15 g/L agar) agar plakaları 100 μg/mL spektinomisin ve E. coli (suş 25922, ATCC) 100 μg/mL ampisilin ile desteklenmiş ATGN agar plakaları üzerinde.
   NOT: Kullanılan bu malzemelerle hidrojel kapsülleme ve salınımına ilişkin önceki raporlar A. tumefaciens C58 hücreleri
2. ATGN agar plakalarından istenen kolonileri seçin ve gece kültürlerine başlayın. Burada kullanılan E. coli ve B. subtilis suşları için, ATGN sıvı ortamında 24 saat boyunca 215 rpm'de çalkalanırken 37 °C'de kültürleyin. Hücre kültürlerini ileride kullanana kadar -80 °C'de %50 gliserol içinde saklayın.
3. Steril aşılama döngüleri kullanarak gliserol stoklarından her iki suşun kolonilerini seçin ve ATGN sıvı ortamında 37 ° C ve 215 rpm'de 24 saat inkübe edin.

2. Hidrojel oluşumu için gerekli malzemenin hazırlanması

1. Işıkla parçalanabilir PEG-o-NB-diakrilat (Poli(etilen glikol)-orto-nitrobenzil-diakrilat) sentezi
   NOT: PEG-O-NB-diakrilatın kurum içi sentezi iyi tanımlanmış ve daha önce rapor edilmiştir. Alternatif olarak, sentez rutin olduğu için bir kimyasal sentez tesisinden dış kaynak olarak temin edilebilir.
2. Çapraz bağlama arabelleği
   1. Bakteri suşu için seçilen ortamın tarifini alın ve ortamı 2 kat besin maddesi ile hazırlayın. Ortama 100 mM'lik bir nihai konsantrasyona kadar fosfat, örneğin NaH₂PO₄ (Sodyum dihidrojen fosfat) ekleyin. Daha sonra 5 M NaOH (Sodyum hidroksit) (sulu) kullanarak pH değerini 8'e ayarlayın.
   2. Tampon çözeltisini sterilize edin ve daha fazla kullanana kadar -20 °C'de saklayın.
      NOT: Ortamda bulunan geçiş metallerini dışarıda bırakın, çünkü bu metaller tiyollerin disülfidlere oksidasyonunu katalize eder.
3. PEG-o-NB-diakrilat çözeltisi
   1. Alikot PEG-o-NB-diakrilat (3.400 Da moleküler ağırlık) tozunun her mg'ı için, 49 mM PEG-o-NB-diakrilat konsantrasyonuna (98 mM akrilat konsantrasyonu) ulaşmak için 3.08 μL ultra saf su ekleyin.
   2. Çözeltiyi iyice karışana kadar vorteksleyin ve bu çözeltiyi daha fazla kullanana kadar -20 °C'de saklayın.
4. 4 kollu PEG-tiyol çözümü
   1. 4 kollu PEG-tiyol (10.000 Da molekül ağırlığı) hazırlığı için, 20 mM konsantrasyona (80 mM tiyol konsantrasyonu) ulaşmak için mg toz başına 4 μL ultra saf su ekleyin.
   2. Bu çözeltiyi iyice karışana kadar vorteksleyin ve bu çözeltiyi daha fazla kullanana kadar -20 °C'de saklayın.

3. Perfloroalkillenmiş (reaktif olmayan) lamellerin hazırlanması

1. Bir polipropilen slayt postasının içine en fazla 5 cam slayt (25 mm x 75 mm x 1 mm) yerleştirin. Slaytları 20 dakika boyunca% 2 (a/h) deterjan çözeltisi (Malzeme Tablosu) ile sonikleştirin.
2. Slaytları üç kez ultra saf suyla durulayın, ardından slaytları 20 dakika boyunca suda sonikleştirin. Slaytları bir N₂ (nitrojen) akışı kullanarak kurutun.
3. Camın her iki tarafındaki plazma temizliği ( Malzeme Tablosuna bakınız) bölüm 4.1'deki protokole göre 2 dakika boyunca.
4. Plazma ile temizlenmiş slaytları slayt postasına geri yerleştirin ve kabı toluen içinde %0,5 (h/h) trikloro(1H, 1H, 2H, 2H,-perflorooktil) silan çözeltisiyle doldurun. Bu cam slaytların oda sıcaklığında (RT) 3 saat boyunca işlevselleştirilmesine izin verin.
5. Slaytlar işlevselleştirildikten sonra, slaytları slayt postası içinde önce toluen ve ardından etanol (her çözücü ile üç kez) ile durulayın. Ardından, işlevselleştirilmiş her slaytı bir N₂ akışıyla kurutun.

4. Tiyol fonksiyonelleştirilmiş (taban) lamellerin hazırlanması

1. Cam lamellerin plazma temizleyici kullanılarak temizlenmesi
   1. 18 mm x 18 mm'lik lameller bir Petri kabına yerleştirin. Daha sonra Petri kabını bir plazma temizleme odasına yerleştirin ve plazma temizleyicinin gücünü açın.
   2. Manometre 400 mTorr okuyana kadar hazne içindeki havayı temizlemek için vakum pompasını açın.
   3. Basınç göstergesi sabit bir basınca (800-1000 mTorr) ulaşana kadar hazneye hava girmesine izin vermek için ölçüm valfini açın. Ardından, "Merhaba" modunda RF'yi seçin ve lamellerin 3 dakika boyunca açığa çıkmasını sağlayın.
   4. 3 dakika sonra RF modunu ve vakum pompasını kapatın.
   5. Petri kabını hazneden çıkarın, lamellerin çevirisini yapın, lazıma geri yerleştirin ve cam lamellerin diğer tarafını ortaya çıkarın.
   6. Cam lamellerin işlenmemiş tarafını plazma ile temizlemek için 4.1.2-4.1.4 adımlarını tekrarlayın.
   7. İşlemi tamamladıktan sonra Petri kabını hazneden çıkarın ve plazma temizleyiciyi ve vakum pompasını kapatın.
2. Lamellerin piranha solüsyonu ile temizlenmesi ve hidroksilasyonu
   NOT: Cam astarlarını temizlemek ve hidroksillemek için standart pirana temizleme protokolleri kullanılabilir. Piranha çözeltisi,_H2O₂ (Hidrojen peroksit) ve H₂SO₄ (Sülfürik asit) karışımıdır . Cam lamellerin temizlenmesi için alternatif yöntemler de kullanılabilir.
   DİKKAT: Piranha çözeltisi organik çözücüler ile güçlü bir şekilde aşındırıcı ve patlayıcıdır ve çok dikkatli kullanılmalıdır. Uygun kişisel koruyucu ekipmanların (laboratuvar önlüğü, kimyasallara dayanıklı önlük, koruyucu gözlükler, yüz siperi, aside dayanıklı bütil eldivenler) kullanılması gibi uygun güvenlik ve muhafaza önlemleri uygulanmalıdır. Piranha solüsyonu ile temas eden tüm cam eşyalar ve çalışma yüzeyleri kullanımdan önce temiz, kuru ve organik kalıntılardan arındırılmış olmalıdır. Piranha çözeltisi asla kısmen kapalı veya kapalı bir kapta saklanmamalıdır.
   1. Çeker ocak altında ayarlanabilir karıştırma hızına sahip bir ocak gözü manyetik karıştırıcı üzerine 100 mm x 50 mm'lik temiz bir cam tabak yerleştirin ve tabağa 14 mL H₂SO₄ ekleyin.
   2. Teflon kaplı forseps kullanarak küçük, Teflon kaplı manyetik karıştırma çubuğunu kabın içine yavaşça yerleştirin. Ardından, asidin sıçramasını önlemek için karıştırıcıyı yavaşça çevirin.
   3. Ardından, tabağa yavaşça 6 mL H₂O₂ ekleyin ve çözeltinin iyice karışmasına izin verin.
   4. Karıştırıcıyı kapatın, ardından forseps kullanarak karıştırma çubuğunu tabaktan çıkarın. Ardından, forseps kullanarak lamelleri yavaşça kabın içine yerleştirin ve sıcaklığı 60-80 °C'ye ayarlayın.
   5. 30 dakika sonra, forseps kullanarak lamelleri nazikçe çıkarın ve kalan piranha solüsyonunu yıkamak için iki kez deiyonize su (DI) suyuna daldırın.
   6. Su ile duruladıktan sonra, lamelleri bir sonraki kullanıma kadar RT'de DI suda saklayın.
   7. Ocak gözünü kapatın ve piranha solüsyonunun soğumasını bekleyin.
   8. Piranha solüsyonunu atmak için, soğutulmuş piranha solüsyonunu içeren 100 mm x 50 mm'lik cam kabı, hacmi en az 1,5 L olan daha büyük, boş bir cam behere yavaşça yerleştirin. Daha sonra seyreltmek için 1 L su ekleyin ve nötralize etmek için sodyum bikarbonat tozu ekleyin. Sodyum bikarbonatın kabarcıklanmaya ve ısı oluşumuna neden olacağını ve çok yavaş eklenmesi gerektiğini unutmayın; aksi takdirde kabarcıklanma asidin sıçramasına neden olabilir. Daha fazla sodyum bikarbonat ilavesi kabarcıklanmaya neden olmadığında, nötralize edildiğini doğrulamak için pH kağıdıyla pH'ı kontrol edin. Çözelti nötralize edilip soğutulduktan sonra lavaboya dökülebilir.
3. Lamellerin tiyol işlevselleştirilmesi
   1. Kuru toluen içinde %5 (h/h) 269 mM (3-merkaptopropil) trimetoksisilan (MPTS) çözeltisi hazırlayın.
   2. Ayrı 50 mL'lik konik santrifüj tüplerine 10 mL çözelti ekleyin. Her tüpe temizlenmiş bir lamel yerleştirin ve solüsyona batırın.
      NOT: Diğer substratlar tarafından rahatsız edilmeden substratın her iki tarafının tiyolasyonunu sağlamak için 50 mL tüp başına bir lamel kullanılır.
   3. 4 saat sonra, her bir lamel (lamel başına dört yıkama) toluen, 1:1 (h/h) etanol: toluen karışımı ve etanol ile yıkayın.
      NOT: Bu, her bir lamel sırayla belirtilen çözeltileri içeren konik santrifüj tüplerine daldırılarak yapılır.
   4. Alt tabakayı duruladıktan sonra etanole batırın ve bir sonraki kullanıma kadar 4 derecede saklayın.
      NOT: Lamellerin sayısına bağlı olarak, lamellerin birer birer işlenmesi nedeniyle bu yöntem zahmetli hale gelebilir. Birden fazla lamel için, aynı anda birkaç lamel sığdıran Columbia kavanozları kullanılabilir.

5. Silikon mikrotitre dizilerinin imalatı

1. Parilen kaplama: Silikon gofretleri parilen ile kaplamak için önceki araştırma makalelerinde açıklanan standart protokolü kullanın.
2. Mikrofabrikasyon: Barua ve ark. mikro kuyu dizisini tasarlamak ve üretmek. ​

6. Hidrojel oluşumu

1. Cam lamellerde dökme hidrojel oluşumu
   1. Hidrojel öncü çözeltisi: 0,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne 12,5 μL çapraz bağlama tamponu ve ardından 5,6 μL PEG-o-NB-diakrilat çözeltisi ekleyin. Son olarak, karışıma 6,9 μL 4 kollu PEG-tiyol çözeltisi ekleyin.
      NOT: Karışıma 4 kollu PEG tiyolünün eklenmesi çapraz bağlanma reaksiyonunu başlatır. Bu nedenle, hidrojel öncü çözeltisi karıştırıldıktan hemen sonra kullanılmalıdır.
   2. Hidrojel öncü çözeltisinde hücre kapsülleme için 6.1.3-6.1.9 adımlarını izleyin.
   3. Hücre kapsülleme için, adım 6.1.1'den önce, çapraz bağlama tamponunu istenen hücre yoğunluğu ile aşılayın. Daha önce bildirildiği gibi19, çapraz bağlama tamponundaki 7.26 × 10⁷ CFU / mL'lik hücre yoğunluğunun, hidrojel boyunca kapsüllenmiş ~ 90 hücre /^mm2 yoğunluğu ile ilişkili olduğu gözlenmiştir.
   4. Tiyole taban lamelini temiz bir Petri kabına yerleştirin. Lamelin karşılıklı iki tarafına iki ara parçası ( Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirin.
      NOT: Hidrojelin lamel yüzeyine kovalent bağlanması için lamellerin tiyol işlevselleştirilmesi gereklidir. Bu, yüzeydeki tiyol gruplarının ve hidrojel öncü çözeltisinde bulunan akrilat gruplarının reaksiyonu yoluyla yapılır.
   5. Ara parçaları Petri kabına bantlayarak ara parçaları taban lamel üzerine sabitleyin.
   6. Öncü çözeltinin istenen hacmini reaktif olmayan, perfloroalkillenmiş bir cam slayt üzerine pipetleyin.
   7. Perfloroalkillenmiş cam slaytı taban lamel üzerine yerleştirin (Şekil 1C). Hidrojel oluşumunun tamamlanması için RT'de 25 dakika bekleyin.
   8. Jelleşmeden sonra, perfloroalkillenmiş cam slaytı yavaşça çıkarın. Hidrojel, taban lamel üzerine bağlı kalacaktır. ​
      NOT: 12,7 μm kalınlığında bir membran elde etmek için 18 mm x 8 mm lameller için ~7 μL öncü çözelti kullanın (Şekil 1A, B). Daha yüksek hacimlerde öncü çözelti kullanılması, taban lamel altında bir hidrojel ile sonuçlanabilir. Bu, taban lamelinin Petri kabına yapışmasına ve çıkarılmaya çalışıldığında kırılmasına neden olabilir. Ayrıca, lamel altındaki hidrojel kalıntısı mikroskopi için sorunludur. Hızlı bir şekilde çıkarılması hidrojele zarar verebileceğinden, reaktif olmayan perfloroalkillenmiş cam slaytın nazikçe çıkarılması gerekir.
   9. Substratı belirtilen kültür ortamında 60 mm x 15 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin. Burada, 24 saatlik kültür süreleri için 37 °C'de B. subtilis için 100 μg/mL spektinomisin veya E.coli için 100 μg/mL ampisilin ile desteklenmiş ATGN ortamı kullanıldı.

7. Hücre ekstraksiyonu için malzeme hazırlama

1. PDMS (Polidimetilsiloksan) tutucu hazırlama
   1. On adet 18 x 18 mm'lik lamel yığınını birbirine bantlayın ve bu lamel yığınını bir Petri kabının dibine yapıştırın.
   2. PDMS tutucuları imal etmek için, PDMS öncüsünü ve kürleme maddesini plastik bir kapta 10:1 hacim oranında karıştırın, karışımı vakumlu bir kurutucuda gazdan arındırın ve ardından karışımı Petri kabına dökün.
   3. PDMS'yi 80 °C'de 90 dakika kürleyin. Ardından, PDMS tutucuyu çıkarmak için bantlanmış bloğun etrafını kesin ve mikroskopi için daha kolay kullanım için PDMS tutucuyu bir cam slayt üzerine yerleştirin.
2. Mikro şırınga ve hortum hazırlama
   1. 20 cm'lik PTFE (Politetrafloroetilen) boruyu (0,05 iç çap) kesin ve borunun bir ucunu 100 μL'lik bir mikrolitrelik şırıngaya takın.
      NOT: Ekstraksiyon için pipet kullanmaktan kaçının çünkü serbest bırakılan hücreleri bir pipet ucuyla çekmek hidrojel yüzeyine zarar verebilir ve kontaminasyona yol açabilir.

8. Desenli aydınlatma aracıyla hidrojel bozunması

1. Mikroskobu açın ( bkz. Ardından, desenli aydınlatma aracını açın ( bkz.
2. 365 nm LED ışık kaynağı Analog ve Dijital kontrol modülünü açın. Ardından, LED ışık kaynağı kontrol modülünü açın.
3. Mikroskop yazılımını ve desenli aydınlatma aracının yazılımını açın. Donanım yapılandırma penceresi açıldığında, Yükle düğmesini seçin.
   NOT: Buraya üç cihaz yüklenecektir. (Üçüncü taraf kamera, bir kontrol modülü ve desenli aydınlatma aracı)
4. Başlat düğmesine basın. Işık desenleme yazılımı penceresi şimdi açılacaktır. Pencerenin sol kenar çubuğundaki ilk seçenek olan Aygıt Denetimi düğmesini seçin.
5. Desenli aydınlatma aracını kalibre edin.
   NOT: Kalibrasyon, ışığa maruz kalma için kullanılacak aynı mikroskop objektifi ve filtresi ile yapılmalıdır.
   1. Mikroskop objektifini 10x büyütmeye ayarlayın.
      NOT: Bu büyütme, mikroskop merceği ile numune yüzeyi arasında yeterli çalışma mesafesine izin verir. Ayrıca, görüntü penceresi aracılığıyla alma sürecinin gerçek zamanlı olarak izlenmesine ve kaydedilmesine olanak tanır.
   2. Mikroskop merceğini ve filtreyi ışığa maruz kalma için kullanılan ayarlara getirin ve kalibrasyon aynasını mikroskobun altına yerleştirin.
   3. Aygıt Denetimi penceresinde, LED Denetimi sekmesine basın. LED #1'i açın ve ışık yoğunluğunu istediğiniz sayıya ayarlayın. Standart ekstraksiyon deneylerinde bu% 60'a ayarlanmıştır.
   4. Aygıt Denetimi penceresinde desenli aydınlatma aracı ürün adı başlıklı sekmeye basın. Ardından, Izgarayı Göster düğmesine basın.
      NOT: Kalibrasyon aynasına bir ızgara deseni yansıtılacaktır.
   5. Izgaranın yüksek görüntü kalitesini elde etmek için mikroskop odağını ve kamera pozlamasını ayarlayın ve gerekirse ızgara çizgilerini kamera penceresi çerçevesine paralel hizalamak için kamerayı döndürün.
   6. Desenli aydınlatma aracı ürün adı başlıklı sekmenin altındaki Kalibrasyon Sihirbazı düğmesini seçin ve bu pencerede yazılım tarafından sağlanan talimatları izleyin. NOT: Üçüncü taraf bir kamera kurulum penceresi açılacaktır.
   7. Bir kalibrasyon Tipi Seçimi penceresi açılacaktır. Otomatik Kalibrasyon'u seçin ve İleri'ye basın.
   8. Ön Kalibrasyon Ayarı penceresi açıldığında, yazılım talimatlarını izleyin ve İleri düğmesine basın.
   9. Eşleme Bilgileri penceresi açıldığında, bu kalibrasyonu istediğiniz klasöre uygun şekilde kaydedin. Bu, tarih, mikroskop adı, objektif lens ve filtre girilerek yapılır.
   10. Kalibrasyondan sonra desenli aydınlatma aracı ürün adı başlıklı sekme altında bulunan Çalışma Alanı Tanımlama butonuna basarak gerekirse desenli aydınlatma aracının çalışma alanını tanımlayın.
6. Desen hazırlama için Sıra Tasarımı bölümü.
   1. Yazılım penceresinin sol kenar çubuğundaki Sıra Tasarımı düğmesine basın. Ardından, Profil Sırası Düzenleyicisi düğmesine basın.
   2. Profil Sırası Düzenleyicisi penceresi açıldığında, Profil Listesi altındaki Yeni Profil seçeneğini seçin.
      NOT: Şimdi, bir Desen Düzenleyici penceresi açılacaktır.
   3. Farklı desen şekilleri ve boyutları seçerek veya istenirse deseni manuel olarak çizerek ışığa maruz kalmak için istediğiniz deseni hazırlayın.
   4. Dökme hidrojel için daire ve kırık çapraz desenler için 8.6.5- 8.6.6 adımlarını izleyin
   5. Daire desenleri için, tüm koloniyi kapsayacak şekilde hedef bakteri kolonisi üzerinde 30 μm çapında bir daire tanımlayın. Beyaz dolgu rengini seçin.
   6. Kırık çapraz çoğaltmalar için, 3 μm x 8 μm boyutlarında desen çizim penceresinden dikdörtgen şeklini seçin. Hedef koloninin kenarlarına bu boyutlara sahip dört dikdörtgen yerleştirin, desenlerin yarısı koloni ile bir kaplamaya sahipken.
   7. Mikrotitre dizileri için daire ve halka desenleri için 8.6.8-8.6.10 adımlarını izleyin.
   8. Daire desenleri için kuyu çevresine 10 μm çapında bir daire çizin. Beyaz dolgu rengini seçin.
   9. Halka deseni için 20 μm çapında bir daire çizin, kuyunun üzerine yerleştirin ve şekli seçin dolgu rengi beyaz.
   10. Dolgu şekli rengi siyah olan 10 μm çapında başka bir daire deseni çizin ve kuyunun çevresine yerleştirin.
7. Deseni düzenleyin ve şekilleri istenen çıkarma yöntemine göre değiştirin. Desenli aydınlatma aracının çalışma alanı içerisinde istenilen desenin mevcut olduğundan emin olun.
8. Numuneyi bir PDMS tutucuya yerleştirin ve numunenin dehidrasyonunu önlemek ve salınan hücreler için bir taşıyıcı çözelti sağlamak için tanımlanan ortamı numunenin üzerine pipetleyin.
9. Ardından, bunu kalibrasyon aynası ile değiştirin.
10. Hidrojel içindeki kolonilerin keskin bir görüntüsünü elde etmek için mikroskop odağını ayarlayın. İlgilendiğiniz bir koloniyi belirlemek için kolonileri inceleyin.
11. Burada, hücre ekstraksiyonu için farklı desenleri test etmek için kamera görüntüsü numunenin içindeki kolonileri gösterirken ışık desenlerini tasarlayın.
12. Tanımlanan deseni kaydedin. Tanımlanan deseni kaydettikten sonra Oturum Kontrolü bölümünü seçin.
13. Bu kısımda desenli aydınlatma aracı ürün adı ile başlıklı sekmenin altına kaydedilen diziyi ekleyin.
14. Diziyi ekledikten sonra, istenen pozlama konumunu görüntülemek ve ayarlamak için deseni simüle etme seçeneğini seçin.
    NOT: Desenin hedeflenen alana tam olarak yansıtılmasını sağlamak için numune konumu buradan ayarlanabilir.
15. Ardından, LED kontrol sekmesi altında ışık yoğunluğunu %60'a ve pozlama süresini 40 s'ye ayarlayın ve pozlama işlemini başlatın.
16. Hücre salınımını sağlamak için hidrojel bozunmasını gerçek zamanlı ve parlak alan modunda izleyin.
    NOT: Hidrojelin istenmeyen alanlarının bozulmasına ve çapraz kontaminasyona neden olabileceğinden, ışığa maruz kalma sırasında numuneye herhangi bir hareket yapılmasını önleyin.

9. Hücre alımı

1. 365 nm ışığa maruz kaldıktan ve hücre salınımından sonra, hücreler bir mikrolitrelik şırınga ve mikroakışkan tüp kullanılarak toplanır (Şekil 2).
   NOT: Hücre alımı, desen maruziyetinden hemen sonra yapılmalıdır. Bu, serbest bırakılan hücreler ışınlanmış alandan uzaklaşmadan önce lokalize hücre iyileşmesine izin verir.
2. Numunenin açıkta kalan alanını çıplak gözle görselleştirmeye izin vermek için mikroskobu parlak alandan FITC veya TRITC filtresine değiştirin.
3. Açıkta kalan alan bulunduktan sonra, borunun ucunu ışınlanmış noktaya yerleştirin. Ardından, hücre alımını gerçek zamanlı olarak izlemek için mikroskop filtresini tekrar parlak alana değiştirin.
4. Serbest bırakılan hücreleri dikkatlice geri çekmek için borunun diğer ucuna takılı şırıngayı kullanın. Çözeltinin 200 μL'sini geri çekin ve çözeltiyi DNA analizi veya kaplama için 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin.

Results

Şekil 1: Tiyole cam lameller üzerinde hidrojel oluşumu. (A) 12,7 μm kalınlığındaki ara parçalar, reaktif tiyol grupları içeren bir taban lamel kaymasının karşılıklı iki tarafına yerleştirilir. (B) Hidrojel öncü çözeltisi, reaktif olmayan, fl...

Materials