Üronik Asit Karbazol Testi Kullanılarak Bakteriyel Aljinatın Miktar Tayini

Özet

Kaynak: Al Ahmar, R., ve diğerleri. Pseudomonas aeruginosa'nın Küçük Koloni Varyantının Kültürü ve Aljinatının Miktar Tayini. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu video, asit hidrolizinden sonra üronik asitleri tespit etmek için karbazol kullanılarak Pseudomonas aeruginosa tarafından üretilen aljinatı ölçmek için kolorimetrik bir tahlili göstermektedir. Yöntem, araştırma ve klinik çalışmalarda bakteriyel biyokütleye normalize edilmiş aljinat üretiminin karşılaştırmalı analizini sağlar.

Protokol

1. Üronik Asit Karbazol Testi

1. Test edilmesi istenen suşun saf kültüründen tek bir koloni tanımlayın. Steril bir kürdan kullanarak koloniyi seçin ve kürdanı 5 mL Pseudomonas izolasyon suyu (PIB) içeren bir kültür test tüpüne yerleştirin. 24 saat boyunca 37 °C'de bir çalkalayıcı inkübatörde büyütün.
   NOT: Aşağıdaki suşlar, PAO581 (PAO1mucA25), PAO581carA, PAO581carB ve PAO581pyrD, ölçüm için aljinat toplamak üzere PIA (Pseudomonas izolasyon agarı) plakaları veya 0.1 mM urasil ile desteklenmiş PIA plakaları üzerinde büyütüldü.
2. Önceden ısıtılmış bir PIA plakasına 150 μL kültürlü PIB suyu (15 mm x 100 mm plakalar için) veya 450 μL et suyu (15 mm x 150 mm plakalar için) ekleyin. Steril bir hücre yayıcı kullanarak suyu tabağın üzerine yayın. Plakayı 37 °C'de 24 saat büyütün.
   NOT: Plakayı bir tarafa eğerek bir pipet kullanarak plakadaki fazla sıvıyı aspire edin. Protokolde kullanılan hem PIB hem de PIA plakaları, hücrelerin aljinat üretimine yardımcı olmak için karbon kaynağı olarak kullandığı 20 mL/L gliserol içerir.
3. Bir pipet kontrolörü ve steril 50 mL'lik bir pipet kullanarak, yetiştirilen çime %0,85 NaCl (sodyum klorür) ekleyin ve bir hücre yayıcı kullanarak plakayı kazıyarak numuneyi toplayın. Numuneyi 50 mL'lik taze bir pipet kullanarak 50 mL'lik bir toplama tüpüne aspire edin. Numuneleri karıştırmak ve buz üzerine yerleştirmek için numuneyi yüksek vorteksleyin.
   NOT: Eklenen %0,85 NaCl'nin hacmi plakanın boyutuna göre değişir. 15 mm x 100 mm'lik plakalar için 10−30 mL ve 15 mm x 150 mm'lik plakalar için 20−50 mL kullanın.
4. Tek kullanımlık bir küvete 1 mL numune ekleyerek ve bir spektrofotometre kullanarak OD'yi okuyarak numunelerin 600 nm'de (OD₆₀₀) optik yoğunluğunu ölçün. Her örnek için üç kopya okuma elde etmek için bu adımı 2 kez tekrarlayın.
5. Kültür tüplerine 3 mL sülfürik asit/borat çözeltisi ekleyin ve buz üzerinde bekletin. Toplanan numunenin 350 μL'sini test tüplerindeki asit karışımına yavaşça ekleyin ve kısa bir süre düşük vorteksleyin.
   1. 45 mL suya 10.099 g potasyum hidroksit (KOH) tozu ekleyerek borat stoğu hazırlayın. Karışıma 24.74 g borik asit (H₃BO₃ ) ekleyin ve hacmi 100 mL'ye getirin.
   2. 1 L'lik bir şişeyi buzlu bir lavaboya koyun ve 500 mL konsantre sülfürik asitle doldurun. Hazırlanan borat stoğundan 15 mL'yi YAVAŞÇA ekleyin. Şişenin soğumasını bekleyin.
   3. Toplam 25 mL için 10 mL daha borat stoğu ekleyin. Şişe soğuduktan sonra hacmi 1 L'ye getirin.
      DİKKAT: Bu yöntem, yüksek konsantrasyonlu sülfürik asit kullanımına dayanır. Güvenliği sağlamak için uygun kişisel koruyucu ekipman kullanılmalı ve numune için uygun imha protokolüne uyulmalıdır.
      NOT: Pozitif bir kontrol için, bilinen bir D-mannuronik asit konsantrasyonu ve/veya bilinen bir bakteriyel aljinat numunesi, aljinat üreten P. aeruginosa suşları (örneğin, PAO581-PAO1mucA25) aracılığıyla toplanır ve saflaştırılır. Negatif kontrol için, %0.85'lik bir NaCl çözeltisi ve/veya PAO1ΔalgD kullanın (Bakterileri tamamen aljinat üretemez hale getiren algD geninin çerçeve içi silinmesi). İstatistiksel analize yardımcı olmak amacıyla teknik tekrar sayısını artırmak için her numuneden birden fazla tüp yapılabilir. Her numuneden 3−5 tüp hazırlayın.
6. Asit/numune karışımına etanol çözeltisi içinde 100 μL %0.1 karbazol ekleyin. Tüpü kapatın ve 5 saniye boyunca orta ayarda girdap yapın. 55 °C'de 30 dakika kuru bir banyoya koyun.
7. İnkübasyondan sonra tüpleri çıkarın ve kısa bir süre yüksekte girdap yapın ve 5 dakika soğumaya bırakın.
   NOT: Görülecek renk morun bir tonu olacaktır. Renk, 1−2 saat boyunca ölçüm için sabit kalacaktır.
8. Temiz bir küvete 1 mL karışım ekleyerek ve numunelerin OD'sini bir spektrofotometrede 530 nm'de okuyarak her tüpün OD 530'unu okuyun. %0.85 NaCl içeren tüpü spektrofotometrede boşluk olarak kullanın.
9. Bilinen D-Mannuronik asit konsantrasyonlarının (1.024 μg/mL, 512 μg/mL, 256 μg/mL, 128 μg/mL, 64 μg/mL, 32 μg/mL, 16 μg/mL ve 8 μg/mL) seri seyreltmelerinin OD_530'unu ölçerek standart bir eğri hazırlayın. 2x tekrarlayın. Bu okumalardan doğrusal bir denklem çıkarın.
   NOT: Standart eğrinin yalnızca bir kez yapılması gerekir. Ondan çıkarılan doğrusal denklem daha sonraki testler için kullanılabilir.
   1. Standart eğriyi kullanarak her numunedeki aljinat konsantrasyonunu hesaplayın ve OD₆₀₀ başına toplam aljinat miktarını elde etmek için doğrusal denklemdeki aljinat konsantrasyonunu OD_600'e bölün.

Malzemeler