$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Aljinat Miktar Tayini için ELISA
1. Bir mikropipet kullanarak, toplanan numunenin 50 μL'sini işlenmemiş 96 oyuklu bir plakaya ekleyin. Kuyucuklara 50 μL kaplama tamponu (karbonat/bikarbonat tamponu pH 9.6) ekleyin. Plakayı 37 °C'de 2 saat inkübe edin.
NOT: Pozitif bir kontrol için, bilinen bir D-Mannuronik asit konsantrasyonu ve/veya bilinen stabil aljinat üreten bir suş (örn. PAO581-PAO1mucA25) kullanılabilir. Negatif bir kontrol için, %0.85'lik bir NaCl çözeltisi ve/veya PAO1ΔalgD kullanın (algD geninin çerçeve içi silinmesi, bakterileri herhangi bir aljinat üretemez hale getirir). İstatistiksel analize yardımcı olmak amacıyla teknik tekrar sayısını artırmak için her numuneden birden fazla kuyu açılabilir. Her numuneden 3-5 kuyucuk hazırlayın.
2. Bir fışkırtma şişesi kullanarak, plaka kuyucuklarını 2x 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile %0.05 Tween 20 (PBS-T) ile kuyucukları doldurarak yıkayın ve ardından plakayı ters çevirerek boşaltın.
3. Bir mikropipet kullanarak kuyucuklara 200 μL bloke edici tampon (PBS-T'de %10 yağsız süt) ekleyin. Gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
NOT: Buzdolabında buharlaşmayı önlemek için plakayı parafin filme veya streç filme sarın.
4. Bir fışkırtma şişesi kullanarak, plaka kuyucuklarını 2 kez PBS-T ile yıkayın, kuyucukları doldurun ve ardından plakayı ters çevirerek boşaltın.
5. Bir mikropipet kullanarak, kuyucuklara 100 μL seyreltilmiş birincil antikor (fare anti-aljinat monoklonal antikoru) ekleyin ve 37 °C'de 1-2 saat inkübe edin.
NOT: Birincil antikor (fare anti-aljinat monoklonal antikoru), antikor seyreltici solüsyonunda (1x PBS'de %1 yağsız süt) 0.5 μg/mL konsantrasyonda (1 mg/mL stoğun 1:2.000'inin seyreltilmesi) sağlandı.
6. Bir fışkırtma şişesi kullanarak, kuyucukları doldurarak plaka kuyucuklarını 3 kez PBS-T ile yıkayın ve ardından plakayı ters çevirerek boşaltın.
7. Bir mikropipet kullanarak kuyucuklara 100 μL seyreltilmiş ikincil antikor ekleyin ve 37 °C'de 1−2 saat inkübe edin.
NOT: Kullanılan ikincil antikor, antikor seyreltici çözeltisinde 0.25 μg/mL konsantrasyona (0.5 mg/mL stoğun 1:2.000'inin seyreltilmesi) kadar delici keçi anti-fare poli-yaban turpu peroksidaz (HRP) antikoruydu.
8. Bir fışkırtma şişesi kullanarak, plaka kuyucuklarını PBS-T ile 3 kez yıkayın, kuyucukları doldurun ve ardından plakayı ters çevirerek boşaltın.
9. Bir mikropipet kullanarak 100 μL TMB (3,3',5,5'-Tetrametilbenzidin)-ELISA (Enzime Bağlı İmmünosorbent Tahlili) çözeltisi (Malzeme Tablosu) ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
NOT: Olumlu bir reaksiyonun rengi mavinin bir tonu olacaktır.
10. Bir mikropipet kullanarak 100 μL durdurma solüsyonu (2 N sülfürik asit) ekleyin.
NOT: Durdurma solüsyonu eklendiğinde renk maviden sarıya dönecektir. Renk, reaksiyon durdurulduktan sonra 30 dakikaya kadar stabildir.
11. Bir plaka okuyucu kullanarak OD'yi 450 nm'de okuyun.
12. Bilinen D-Mannuronik asit konsantrasyonlarının (1.024 μg/mL, 512 μg/mL, 256 μg/mL, 128 μg/mL, 64 μg/mL, 32 μg/mL, 16 μg/mL ve 8 μg/mL) seri seyreltmelerinin OD450'sini ölçerek standart bir eğri oluşturun. 2x tekrarlayın. Bu okumalardan doğrusal bir denklem çıkarın.
NOT: Standart eğrinin yalnızca bir kez yapılması gerekir. Ondan çıkarılan doğrusal denklem daha sonraki testler için kullanılabilir.
1. Standart eğriyi kullanarak her numunedeki aljinat konsantrasyonunu hesaplayın ve OD600 başına toplam aljinat miktarını elde etmek için doğrusal denklemdeki aljinat konsantrasyonunu OD600'e bölün.