Murin Vajinal Kolonizasyonunun Anaerobik Bakterilerle Modellenmesi

Özet

Kaynak: Morrill, S.R., ve diğerleri. Anaerobik olarak yetiştirilen bakteriler tarafından murin vajinal kolonizasyon modelleri. J. Vis. Uzm. (2022)

Bu video, antibiyotiğe dirençli anaerobik bakteriler kullanılarak farelerde vajinal kolonizasyonun modellenmesine yönelik bir protokolü göstermektedir. Epitel duyarlılığını artırmak için hormonal tedavi ile başlar, ardından anaerobik koşullar altında vajinal aşılama ve ko-aşılama ile devam eder. Prosedür, bakteri kolonizasyonunu ve biyofilm oluşumunu değerlendirmek için aşılama sonrası örnekleme ve kültür ile sona erer.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. İnokulumun hazırlanması

NOT: Bu bölüm, anaerobik olarak yetiştirilen streptomisine dirençli Gardnerella vaginalis JCP8151B-SmR'den aşının hazırlanması için genel adımları içerir. Bu bölümdeki tüm adımlar anaerobik bir odada yapılmalıdır.

1. Hazırlanmış New York City et suyu III (NYCIII), agar ve Fosfat Tamponlu Salin (PBS) dahil olmak üzere tüm reaktifleri, kullanımdan önce en az 24 saat dengelemek için anaerobik bir odaya koyun.
   NOT: Burada, %5'lik bir hidrojen gazı karışımı ile dengelenmiş bir vinil anaerobik oda kullanıldı. Dahili oksijen konsantrasyonu tipik olarak 0 ppm'de durur, ancak malzemeleri hazneye döndürürken düşük seviyeli geçici artışlar (10-25 ppm) olabilir.
2. Vajinal aşılamadan iki gün önce, Gardnerella'yı donmuş bir gliserol stoğundan anaerobik odadaki bir NYC III agar plakasına çizin. Haznenin içinde ve dışında taşıma sırasında gliserol stoğunu donmuş halde tutmak için kuru buzla dolu küçük bir kap (boş bir pipet uç kutusu gibi) kullanın.
3. Vajinal aşılamadan 1 gün önce, 10 mL NYC III et suyunu aşılamak için plakadan 5-10 ayrı Gardnerella kolonisi kullanın. Sıvı kültürün 37 ° C'de 16 saat boyunca gece boyunca büyümesine izin verin. Aşılanmamış kültür ortamının ikinci bir 1 mL alikotunu ekleyin ve ortamın kontamine olmadığını doğrulamak için aşılanmış kültürün yanında inkübe edin.
4. İnokulumu aşağıda açıklandığı gibi sıvı kültürden hazırlayın. İnokulum hazırlığını mümkün olduğunca anaerobik odada gerçekleştirin.
   1. 1.5 mL'lik bir küvette (1:5 seyreltme) 800 μL taze ortama 200 μL kültür ekleyerek kültür optik yoğunluğunu (OD) belirleyin. Seyreltilmiş kültürün yoğunluğunu (OD) 600 nm dalga boyunda ölçmek için bir spektrofotometre kullanın (boşluk olarak yalnızca taze ortama sahip ayrı bir küvet kullanın). 16 saatlik kültürün gerçek OD_600'ünü elde etmek için OD okumasını 5 ile çarpın.
   2. Deney için gereken inokulum hacmini hesaplayın. Örneğin, 15 fareyi fare başına 20 μL'lik bir inokulum ile enfekte etmek için 15 x 20 μL = 300 μL inokulum gereklidir. Gerekenden yaklaşık% 25 daha fazla inokulum hazırlayın, bu nedenle 15 fare için 300 μL + (0.25 x 300 μL) = 375 μL inokulum hazırlayın.
   3. Adım 1.4.1'de belirlenen OD_600'ü kullanarak, adım 1.4.2'de hesaplanan hacimde bir OD₆₀₀ = 5.0 aşı elde etmek için döndürülmesi ve yeniden süspanse edilmesi gereken 16 saatlik kültürün hacmini hesaplayın. Örneğin, kültürün OD_600'ü 1.5 ise ve gereken aşı hacmi 375 μL ise, döndürülecek kültür hacmi (375 μL x 5)/1.5 = 1250 μL'dir.
   4. Adım 1.4.3'te hesaplanan kültür hacmini pipetleyin. steril bir mikrosantrifüj tüpüne. Bakterileri 16.000 x g'da 1-3 dakika santrifüjleyerek pelet haline getirin.
   5. Süpernatanı çıkarın ve peleti adım 1.4.2'de hesaplanan hacimde anaerobik PBS'de yeniden süspanse edin. Aşı şimdi hesaplanmış bir OD₆₀₀ 5.0'da olacaktır. Varsa, enfekte olmamış kontrol grubundaki fareler için bir araç kontrolü görevi görecek bir PBS tüpü de hazırlayın.
5. İnokulum tüpünü anaerobik odadan çıkarmadan önce, PBS'de 1:10 ila 1:10 x 10⁶ arasında bir seri seyreltme serisi hazırlayın. Spot plaka 5, aşının Koloni Oluşturan Birimlerini veya CFU'sunu belirlemek için çok kanallı bir pipet kullanarak her seyreltmenin bir agar plakası üzerinde kopyalarını oluşturur. Bu, aşılama öncesi CFU'dur.
6. Gardnerella ile vajinal ön lavaj ve aşılama
   1. Anaerobik odada vajinal lavaj/yıkama tüpleri hazırlayın. 70 μL steril, anaerobik PBS'yi fare numaralarıyla etiketlenmiş 1.5 mL'lik mikrosantrifüj tüplerine pipetleyin. Fare başına bir yıkama tüpü hazırlayın. Tüpleri sıkıca kapatın ve anaerobik odadan dışarı çıkarın.
   2. Adım 2.1'de hazırlanan ayrı tüplerden 50 μL anaerobik PBS ile her fareye vajinal lavaj yapın. Bu vajinal lavajlar aşılama öncesi yıkamalardır ve aşağı akış ölçümleri ve tahlilleri için kullanılabilir.
      1. İkinci β-estradiol valerat enjeksiyonunun uygulanmasından sonra, her fareyi bir kafesin üzerine veya ön ayaklarıyla kavrayabileceği temiz, sert bir yüzeye yerleştirin. Kuyruğun orta kısmını nazikçe kavrayın ve arka bacaklar hafifçe yükselecek ve vajinal açıklık ortaya çıkacak şekilde kaldırın.
      2. Bir pipet ve p-200 filtre ucu kullanarak, uygun fareye karşılık gelen yıkama tüpünden 50 μL PBS çekin. Pipet ucunu yavaşça ~2-3 mm vajinal lümene sokun ve 50 μL hacmi yavaşça içeri ve dışarı doğru 3x-4x pipetleyin.
      3. Toplanan yıkama malzemesini (~50 μL) geldiği yıkama tüpüne geri aktarın ve kalan 20 μL PBS'yi içeren yıkama tüpünde yukarı ve aşağı pipetleyin. Aşırı mukus varsa ve uç tıkanırsa, kalan malzemeyi toplamak için temiz bir p200 ucu kullanın ve aynı yıkama tüpüne yerleştirin.
   3. Her farenin vajinasına 20 μL konsantre bakteri süspansiyonu veya araç kontrolü vajinal olarak uygulayın. Her fareyi, o fare için vajinal lavajın hemen ardından aşılayın (yani, bir sonrakine geçmeden önce her fare için sırayla lavaj ve aşılama yapın). Bu işlemi basitleştirmek için, biri lavajlar için 50 μL'ye, diğeri aşılamalar için 20 μL'ye ayarlanmış iki p200 pipeti kullanın.
      1. Fareyi adım 2.2.1'de açıklandığı gibi kısıtlayın. Bir p-200 ucu kullanarak vajinaya 20 μL bakteri süspansiyonu pipetleyin. İki farklı bakteri türü/suşu kullanan ortak aşılama deneyleri için, her bir bakteri süspansiyonundan 10 μL kullanın ve aşılamadan önce iki suşu karıştırmaktan kaçının.
         NOT: Vajinadan yayılmayı önlemek için toplam aşılama hacmi 20 μL'yi geçmemelidir.
      2. Uygulanan hacmin vajinal girişte hemen birikmesini önlemek için her farenin arka ucunu 10-20 saniye tutmaya devam edin. Ardından, fareyi yeni bir kafese/kaba veya önceden aşılanmış kafes arkadaşlarına yerleştirin.
      3. Adım 2.2'yi tekrarlayın. ve adım 2.3. her fare için. Fareleri asla henüz aşılanmamış hayvanlarla birlikte bir kafese geri koymayın. Bu, aşılamadan önce farelerin yanlışlıkla streptomisine dirençli bakterilere maruz kalmasını önler.
   4. Tüm fareler aşılandıktan sonra, aşı tüpünü anaerobik odaya geri döndürün. Adım 1.5'te açıklandığı gibi başka bir seri seyreltme hazırlayın ve kaplayın. Bu, aşılama sonrası CFU'dur. Hayvanların aşılanması sırasında anaerobik odanın dışındayken aşının canlılığının azalıp azalmadığını belirlemek için aşılama sonrası ve aşılama öncesi plakalardaki CFU'ları karşılaştırın.
   5. Adım 2.2'de toplanan vajinal lavajları plakalayın. seçici agarda (bu durumda 1 mg/mL streptomisin). Plakaları 37 °C'de anaerobik bir odada 1-2 gün inkübe edin ve büyüme olup olmadığını inceleyin. NOT: Büyüme, mikrobiyomun endojen üyelerinin seçim belirtecine dirençli olduğunu ve bu nedenle hedef organizmanın CFU sayımını gizleyebileceğini gösterir.
7. Canlı Gardnerella kolonizasyonunu belirlemek için vajinal lavajların toplanması
   1. Vajinal kolonizasyonu analiz etmek için vajinal yıkamaları belirli zaman noktalarında toplayın. Adım 2.2'de açıklandığı gibi toplayın.
   2. Toplandıktan hemen sonra vajinal lavajları anaerobik bir odaya çevirin. Adım 1.5'te açıklandığı gibi seçici agar üzerine seri seyreltme ve kaplama yapmak için her lavajdan 10 μL kullanın. CFU sayımlarını Gardnerella (veya ilgilenilen başka bir anaerob) tarafından vajinal kolonizasyonun bir ölçüsü olarak kullanın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
β-estradiol 17-valerat	Sigma	E1631	Farelerin östrojenizasyonu
1x PBS	Balıkçı	MT21040CM	vajinal lavaj, G. vaginlalis inoculum preparasyonu, doku toplama ve homojenizasyon
Anaerobik oda	Çekingen	7200000	Anaerobik bakterilerin büyümesi
Bacto agar	Balıkçı	DF0140074	G. vaginalis, F. nucleatum ve P. bivia agar plakaları
Glikoz	Sigma	G7528 Serisi	G. vaginalis büyümesi için NYCIII ortamı
HEPES	Hücre Grubu	25-060-Cl	G. vaginalis büyümesi için NYCIII ortamı
At serumu	Kanama durdurucu	SHS500 Serisi	G. vaginalis büyümesi için NYCIII ortamı
Hidrojen gazı karışımı (%5 hidrojen, %10 CO₂, %85 nitrojen)	Matheson		Anaerobik oda için gaz
Milli-Q Su Arıtma Cihazı	Kırlangıç	IQ-7000 Serisi	medya yapımı ve homojenizasyon için
NaCl	Sigma	S3014 Serisi	G. vaginalis büyümesi için NYCIII ortamı
Azot gazı	Hava gazı		Anaerobik oda için gaz
P-200 Filtre Uçları	ISC Biyografisi	P-1237-200 Serisi	vajinal lavajlar ve bakteri aşılamaları
Susam yağı	Balıkçı	ICN15662191	Farelerin östrojenizasyonu
Spektrofotometre	Biyokrom	80-3000-45	bakteriyel OD₆₀₀ ölçümü
Streptomisin	Gibco	11860038	Seçici plakalar yapmak için agar ortamına ekleyin
Maya özü	Balıkçı	DF0127-17-9 Serisi	G. vaginalis büyümesi için NYCIII ortamı