Mikroenjeksiyon Kullanılarak Zebra Balığı Larvasının Bağırsak Lümenine Bakterilerin Lokalize Verilmesi

Özet

Kaynak: Li, J. ve diğerleri. Clostridioides difficile için Larva Zebra Balığı Enfeksiyon Modelinin Geliştirilmesi. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu video, floresan etiketli Clostridioides difficile'nin anestezi uygulanmış bir zebra balığı larvasının bağırsak lümenine mikroenjeksiyon bazlı dağıtımını göstermektedir. Larva hazırlama, bakteri enjeksiyonu ve bağırsaktaki bakteri lokalizasyonunun floresan mikroskobu tabanlı doğrulanması ile ilgili adımları özetlemektedir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Zebra Balığı Larvalarına Lekeli Clostridioides difficile Enjeksiyonu

1. Döllenmeden 5 gün sonra 20-30 zebra balığı larvasını (burada 5 dpf olarak anılacaktır) %0.02-%0.04 trikain ile uyuşturun (trikain tozu çift damıtılmış suda çözülür ve 1 M Tris-HCL çözeltisi ile pH = 7'ye ayarlanır) enjeksiyondan ~10 dakika önce %30 Danieau ortamında. Anestezi uygulanmış larvaları 10 cm'lik taze bir Petri kabına aktarın ve fazla% 30 Danieau'nun ortamını çıkarın.
2. Zebra balığı larvalarının üzerini örtmek için bir damla %0,8 düşük erime noktalı agaroz damlatın. Larvaları yavaşça yanal konuma ayarlayın. Düşük erime noktalı agarozun katılaşmasını sağlamak için Petri kabını 30-60 saniye buz üzerine yerleştirin. Agarozu örtmek için %0,02-%0,04 trikain içeren %30 Danieau ortamı ekleyin.
3. Enjeksiyon solüsyonunu hazırlayın. Enjeksiyon işlemini görselleştirmek için 9 μL boya boyalı Clostridioides difficile inokuluma fosfat tamponlu salin (PBS) çözeltisinde 1 μL %0.5 fenol kırmızısı ekleyin.
4. Kalibre edilmiş bir mikroenjeksiyon iğnesini bir mikro yükleyici kullanarak enjeksiyon solüsyonuyla yükleyin. Yüklenen iğneyi bir mikromanipülatöre monte edin ve bir stereomikroskop altına yerleştirin.
5. Enjeksiyon basıncını 600–900 hPa arasında ayarlayın. 0,5–1,0 nL elde etmek için enjeksiyon süresini 0,1–0,3 s olarak ayarlayın. İğneyi mikromanipülatörde, gömülü larvalara doğru ~45°'lik bir açıyla ayarlayın.
6. İğne ucunu gastrointestinal sistemin üzerine, ürogenital gözeneğe yakın bir yere yerleştirin. Agarozu, ardından iğne ucuyla kası delin, ardından bağırsak lümenine yerleştirin ve 0,5-1,0 nL Clostridioides difficile enjekte edin. Enjekte edilen larvaları izlemek için bir floresan mikroskobu kullanın ve konfokal görüntüleme için uygun şekilde enjekte edilen larvaları alın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Agaroz düşük erime noktalı (LM)	Pronadisa Hakkında	8050	Agaroz plakalarda kullanılır
BacLight Kırmızı Bakteri Lekesi	Thermo Fisher Bilimsel	B35001 Serisi	Floresan boya
Kılcal Cam	Harvard Aparatı	30-0019	Enjeksiyon iğneleri
Clostridioides difficile			R20291, bir ribotip 027 suşu, TcdA+/TcdB+/CDT+ üretimi
DMSO'nun	Carl Roth GmbH	A994 Serisi
FİJİ	Açık kaynak platformu		Görüntü işleme
Mikro enjektör	Eppendorf Hakkında	5253000017
Leica SP8 konfokal mikroskop	Leica
Fenol Kırmızısı	Sigma-Aldrich	P0290
Trikain	Sigma-Aldrich	E10521 (İngilizce)