Larva Zebra Balığı Bağırsağından Clostridioides difficile Bakterilerinin İzolasyonu ve Kültürü

Özet

Kaynak: Li, J., vd. al., Clostridioides difficile için Larva Zebra Balığı Enfeksiyon Modelinin Geliştirilmesi. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu video, Clostridioides difficile bakterilerinin larva zebra balığının bağırsağından izolasyonunu ve kültürlenmesini göstermektedir. Enfekte bağırsak diseke edilir, homojenize edilir ve antibiyotik içeren seçici anaerobik ortamda inkübe edilir. Bu koşullar rakip mikropları baskılar ve canlı hücrelerin büyümesini destekler.

Protokol

Canlı Clostridioides difficile'yi Kurtarmak için Larva Zebra Balığı Bağırsağının Diseksiyonu

1. Bakteri yükünü analiz etmek için gastrointestinal yolları larvalardan izole edin. Zebra balığı larvalarına %0,4 trikain ile ötenazi yaparak başlayın.
2. Zebra balığını steril 1x PBS (Fosfat Tamponlu Salin) ile kısa bir süre durulayın ve taze bir agaroz tabağına aktarın.
3. Zebra balığının diseksiyonu
   1. Zebra balığını hareketsiz hale getirmek için zebra balığı larvalarının sırt gövdesine kafaya yakın bir iğne sokun. Bir neşterle solungaçların arkasındaki kafayı çıkarın.
   2. İkinci iğneyi sırt gövdesinin ortasına sokun. Üçüncü iğneyi zebra balığının karnına sokun ve bağırsağı vücut boşluğundan dışarı çekin.
      NOT: Sağlam bağırsağı izole etmek için çok dikkatli olunması gerekir. Bunu yapmak zorsa, bağırsağın geri kalanını kalan iç organlardan ayırmak için ek çekmeler yapın.
   3. 10-15 bağırsağı 200 μL steril 1x PBS içeren 1,5 mL'lik bir tüpe aktarmak için bir mikroenjeksiyon iğnesi kullanın.
   4. Dokuyu bozmak ve homojenatlar hazırlamak için bağırsakları bir havaneli ile homojenize edin. Tüm bağırsakları tamamen bozmak için havaneli tüpün dibine ulaştığından emin olun.
4. Homojenatları, D-sikloserin ve sefoksitin içeren C. difficile yetiştirme ortamında, taurokolatlı veya taurokolatsız (TCA, C. difficile sporlarının bir çimlenmesi) anaerobik bir odada inkübe edin.
5. Plakayı 37 °C'de 48 saat anaerobik olarak inkübe edin.

Malzemeler