Laktik Asit Bakterilerinin Canlanması ve Büyümesi

Özet

Kaynak: Ayivi, R. ve diğerleri, Laktik Asit Bakterilerinin Yetiştirilmesi, Büyümesi ve Yaşayabilirliği: Bir Kalite Kontrol Perspektifi. J. Vis. Uzm. (2022)

Bu video, donmuş bir gliserol stoğundan soğuk stresli laktik asit bakterilerinin geri kazanılması, anaerobik inkübasyon yoluyla bakteri canlılığının geri kazanılması ve kültür genişlemesi için aktif kolonilerin izole edilmesi yöntemini göstermektedir.

Protokol

1. Laktik asit bakteri (LAB) kültürlerinin aktivasyonu ve kalite kontrolü için protokol

1. LAB suşlarının hazırlanan gliserol stoğunu (2 mL'lik santrifüj tüplerinde) -80 °C ultra düşük dondurucudan alın ve kullanmadan önce çözülmelerine izin vermeyin.
2. Santrifüj tüplerinin açıklığını %70 alkolle temizleyin ve dezenfekte edin ve kullanmadan önce hafifçe vorteks yapın.
3. Santrifüj tüplerinden taze 2 mL MRS (deMan, Rogosa ve Sharpe ortamı) test tüplerine yaklaşık 250 μL (0,25 mL) stok LAB kültürünü pipetleyin.
4. Yavaşça vorteksleyin, test tüplerini parafilme alın ve gece boyunca 42 °C'de 12-16 saat boyunca anaerobik olarak inkübe edin.
5. 2 mL MRS test tüplerinden gece boyunca yetiştirilen kültürlerin yaklaşık 500 μL'sini (0,5 mL) taze 7 mL MRS test tüplerine alın, vorteksleyin ve gece boyunca 42 °C'de 12-16 saat anaerobik olarak inkübe edin.
6. UV-görünür bir spektrofotometre ile 610 nm'de optik yoğunluğu (OD) veya kültürlerin büyümesini ölçerek ve 0,7 ile 0,9 arasında kabul edilebilir sonuçlar kaydederek mikrobiyal büyümeyi değerlendirin.
7. 7 mL MRS tüplerinden gece boyunca kültürleri MRS ve MRCM-PYR (modifiye takviyeli klostridyal ortam-piruvat) agar plakalarına çizin ve 42 ° C'de 72 saat boyunca anaerobik olarak inkübe edin.
8. İzole edilen koloniler agar plakalarından toplanır, taze 7 mL MRS test tüplerine aktarılır, hafifçe vortekslenir ve gece boyunca 42 °C'de 12-16 saat anaerobik olarak inkübe edilir.
9. İzole suşları içeren agar plakalarını buzdolabında bir hafta boyunca 4 °C'de saklayın.
10. 610 nm'de çizgili plakalardan izole edilen LAB kültürlerinin 7 mL MRS test tüplerinden OD'yi (0,7 ile 0,9 arasında) ölçün ve onaylayın ve bunları ilgili tüm deneyler için çalışma kültürleri olarak kullanın.
11. 1:10 oranını elde etmek için, 9 mL pepton suyu (fizyolojik bir tampon) kullanarak son 7 mL MRS test tüplerinden yetiştirilen LAB kültürlerinin on kat seyreltilmesini (seri seyreltmeler) gerçekleştirin.
12. Son olarak, tüm fermantasyon deneyleri için uygun seri seyreltmelerden yaklaşık 250 μL (0,25 mL) alın.
13. Adım 2.12'den itibaren suşlar (250 μL) içeren suyu, taze 7 mL MRS suyuna aktararak ve 16 saat boyunca 42 ° C'de anaerobik olarak inkübe ederek etkinleştirin.
    NOT: Tüm L. bulgaricus suşları, taze hazırlanmış MRS suyunda aktive edildi ve daha sonra 0,7 ile 0,9 arasında bir bakteri üremesinin optik yoğunluğuna (OD₆₁₀ nm) ulaşmak için 42 °C'de 16 saat boyunca anaerobik olarak inkübe edildi. Bakteri üremesi, 610 nm'de UV-görünür bir spektrofotometre ile ölçüldü. Gece kültürlerinin pH değerleri, LAB fermantasyonunun organik bir son ürünü olan laktik asit üretiminin bir sonucu olarak 3.5 ila 5.3 aralığındaydı. Biyogüvenlik davlumbazında uygun hava akımı sirkülasyonu ve Bunsen brülörünün kullanımı sırasında yanıkların önlenmesi gibi güvenlik prosedürlerine uyuldu ve bunlara uyuldu.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Anilin Mavisi	Termo Bilimsel	R21526 (İngilizce)	25 gr
Sığır eti özü	Araştırma Ürünleri Uluslararası	50-197-7509	500 gr
Maya özü	Fisher Bilimsel	BP1422-500 Serisi	500 gr
Kalsiyum Klorür dihidrat	Fisher Bilimsel	C79-500 Serisi	500 gr
Dekstroz Susuz	Fisher Bilimsel	BP350500	500 gr
D-Fruktoz	ACROS Organikler	AC161355000	500 gr
Difco agar tozu	Difco	DF0812-07-1	2 kg
TPY agar	Difco	211921	500 gr
Eppendorf mikrosantrifüj tüpü (Snap-Cap Mikrosantrifüj Safe-Lock)	Fisher Bilimsel	05-402-12	2 mL
Gliserol	Termo Bilimsel	PI17904	500 mL
Kızılötesi CO₂ İnkübatör	Forma Bilimsel
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC)	ATCC 11842
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Bulgaristan	S9
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Bulgaristan	LB6
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Gıda Mikrobiyolojisi ve Biyoteknoloji Laboratuvarı (NCATSU)	Küçük karga
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Gıda Mikrobiyolojisi ve Biyoteknoloji Laboratuvarı (NCATSU)	E22
Lactobacillus reuteri	Biogai, Raleigh / Gıda Mikrobiyolojisi ve Biyoteknoloji Laboratuvarı (NCATSU)	RD2
L-Sistein hidroklorür monohidrat	Sigma-Aldrich	C6852-25G	25 gr
Maltoz monohidrat	Fisher Bilimsel	M75-100 Serisi	100 gr
Bayan et suyu	Neojen	50-201-5691	5 kg
Pepton No. 3	Hach	50-199-6719	500 gr
Potasyum fosfat dibazik (K₂HPO₄)	Araştırma Ürünleri Uluslararası	50-712-761	500 gr
Sodyum asetat trihidrat	Fisher Bilimsel	S220-1	1 kg
Sodyum klorür	Fisher Bilimsel	BP358-1	1 kg
Sodyum piruvat	Fisher Bilimsel	BP356-100 Serisi	100 gr
Kauçuk Kaplı Vidalı Kapaklı Test Tüpleri	Fisher Bilimsel	FB70125150	25 x 150 mm
Ara 80	Fisher Bilimsel	T164-500 Serisi	500 mL
Ultra düşük dondurucu	Çok Düşük
Urasil	ACROS Organikler	AC157301000	100 gr
UV-görünür spektrofotometre	Thermo Fisher Bilimsel	Evrim 201
Girdap Cini 2	Fisher Bilimsel
Maya özü	Fisher Bilimsel	BP1422-500 Serisi	500 gr
Etanol	Fisher Bilimsel	T08204K7	4 L
Hidroklorik asit (6N (Sertifikalı), Fisher Chemical)	Fisher Bilimsel	SA56-500 Serisi	500 mL