$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Polimer Mikrodizilerin Bakterilerle Aşılanması
NOT: İyi bir aseptik teknik sağlayın. Kültürlerin tüm işlemleri steril bir ortamda yapılmalıdır: ya bir Bunsen brülörü kullanılarak ya da bir akış başlığında. Kültürler, oksijen mevcudiyeti, büyüme ortamı ve sıcaklık her türün gereksinimlerine göre ayarlanarak yetiştirilmelidir.
- 5 mL Luria-Bertani suyunu (LB: 10 g/L Bakto-tripton, 5 g/L sodyum klorür, NaCl ve 10 g/L maya özütü) bir tabaktan bir koloni ile aşılayarak gece kültürleri hazırlayın. Gece boyunca 37 °C'de, 200 rpm'de (dakikadaki devir) çalkalayarak inkübe edin.
- Gliserol (toplamda %10 konsantrasyon) ilavesiyle gece kültürlerinin dondurucu stoklarını hazırlayın ve stoğu -80 °C'de saklayın.
- Çözülmüş bakteri stoklarının örneklerinden hücre sayılarını belirlemek için, her bir stokun seri seyreltmelerini gerçekleştirin ve bakterileri gece boyunca katı ortamda büyütün. Stoklardaki hücre sayılarının doğru belirlenmesi, her türün uygun şekilde aşılanmasını sağlar.
- Mikrodizi için aşı hazırlayın. Tek tür kültürler yukarıdaki gibi büyütülür ve doğrudan mikrodizilere uygulanır. BacMix-1, Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae), Staphylococcus saprophyticus (S. saprophyticus) ve Staphylococcus aureus'un (S. aureus) bakteriyel bir karışımıdır. BacMix-2, Streptococcus mutans (S. mutans), S. aureus, K. pneumoniae ve Enterococcus faecalis'ten (E. faecalis) oluşan bir bakteri karışımıdır.
- Karışık kültürlerden herhangi birini üretmek için, gece boyunca eşit hacimlerde (her biri 3 ml) karıştırın ve taze LB ile dört kez seyreltin (yaklaşık 50 ml nihai hacme kadar).
- Ultraviyole ile sterilize edilmiş polimer mikrodizileri dikdörtgen 4 oyuklu plakalara yerleştirin ve 6 ml karışık bakteri kültürü ile 37 °C'de 5 gün boyunca hafif çalkalama (30 rpm) ile inkübe edin.
- İnkübasyondan sonra, mikrodizileri fosfat tamponlu salin (PBS: 137 mM NaCl, 2.7 mM potasyum klorür, KCl, 10 mM disodyum hidrojen fosfat, Na2HPO4 , 1.8 mM potasyum dihidrojen fosfat, KH2PO4 ) ile iki kez nazikçe durulayın ve PBS'de 30 dakika boyunca 1 μg / ml 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) boyası çözeltisi ile inkübe edin.
- Lekeli mikrodizi slaytlarını taze bir kuyu plakasında PBS ile kaplayarak ve hafifçe döndürerek PBS'yi bir kez değiştirerek yıkayın. Hava akımı altında kurutun. Mikrodizi slaytına bir cam lamel uygulayın ve yapıştırıcı ile yerine kapatın. Kuruduktan sonra dış yüzeyi %70 (h/h) etanol ile sterilize edin.
- Kültürleri muhafaza seviyelerine göre güvenli bir şekilde atın.
2. Mikrodizi Görüntüleme ve Analizi
- Parlak alan ve DAPI (Uyarma/Emisyon, Ex/Em = 358 nm / 361 nm) kanallarında her polimer noktası için tek görüntü yakalayın. Bunu bir floresan mikroskopla manuel olarak veya 20X objektifle donatılmış otomatik bir floresan mikroskobu (bir görüntü toplama yazılımı tarafından kontrol edilen bir XYZ aşaması ile) kullanarak gerçekleştirin.
NOT: Parlak alan ve DAPI kanallarını kullanarak görüntü elde etmek için mikroskobu ayarlayın. Tüm mikrodiziler için görüntü yakalama için kazanç ve pozlama süresinin aynı olduğundan emin olun. - Spot alanını seçerek ve bir görüntü işleme yazılımı ile floresansı ölçerek DAPI kanalındaki her noktanın ortalama floresan yoğunluğunu elde edin.
- Her noktanın arka plan floresansı için, yalnızca bakteri içermeyen ortamla inkübe edilmiş kopya bir mikrodizi üzerindeki polimer noktalarının görüntülerini elde edin. Bakterilerden floresan elde etmek için arka plan floresansını lekenin yoğunluğundan çıkarın.
- Çeşitli polimerlerin bakteri bağlanmasını karşılaştırmak için kullanılan, her bir polimeri temsil eden dört noktadan ortalama normalleştirilmiş değeri hesaplayın.
- En az bakteri bağlanması (en düşük floresan) sergileyen polimerleri 'isabet' polimerler olarak tanımlayın.