Moleküler Analiz için Su Numunesinden Antibiyotiğe Dirençli Bakterilerin İzolasyonu

Özet

Kaynak: Ghadigaonkar, D. ve Rath, A. Su Kaynaklı Antibiyotiğe Dirençli Bakterilerin İzolasyonu ve Tanımlanması ve Antibiyotik Direnç Genlerinin Moleküler Karakterizasyonu. J. Vis. Uzm. (2023)

Bu video, seçici ortam kullanılarak bir su örneğinden antibiyotiğe dirençli bakterilerin izolasyonunu ve hazırlanmasını göstermektedir. DNA, antibiyotiğe dirençli bakterilerden ekstrakte edilir ve bakteriyel antibiyotiğe dirençli genleri tanımlamak için çoğaltılır.

Protokol

1. Numune toplama ve işleme

1. Örnek toplama
   1. Uygun hacimdeki su numunesini steril numune kaplarında toplayın ve kabın 3/4'ünden fazlasının doldurulmadığından emin olun.
   2. Numuneleri toplandıktan sonra mümkün olan en kısa sürede aseptik koşullar altında laboratuvara taşıyın ve hemen işleyin.
2. Örnek işleme
   1. Herhangi bir partikül maddeyi çıkarmak için su örneğini steril bir muslin bezden aseptik olarak süzün.
   2. Daha fazla analiz için filtrelenmiş suyun uygun seri seyreltmelerini gerçekleştirin.

2. Toplam bakteri yükünün ve antibiyotiğe dirençli bakteri sayısının tahmini

1. Toplam bakteri yükünün belirlenmesi
   1. 18.12 g Reasoner's 2A agar (R2A agar) modifiye tozunu 1.000 mL çift damıtılmış suda süspanse edin ve karışımı ısıtarak çözün. Çözünmüş karışımı 121 °C'de, inç kare başına 15 pound (psi) sıcaklıkta 20 dakika otoklavlayın. Otoklavlanmış karışımın uygun miktarını steril Petri plakalarına dökerek R2A Agar Modifiye plakalarını hazırlayın (örneğin, 90 mm'lik steril bir Petri plakasına yaklaşık 20 mL otoklavlanmış steril ortam ekleyin).
   2. Ortam katılaştıktan sonra, filtrelenmiş su numunesinin uygun seyreltmelerinden 100 μL'yi R2A Agar, Modifiye plaka üzerine eşit olarak yayın. Deneyi iki kopya halinde gerçekleştirin.
   3. Yukarıdaki tüm plakaları 35 - 37 °C'de 48 saat inkübe edin (izolasyon için kullanılan ortama bağlı olarak sıcaklığı ve inkübasyon süresini değiştirin).
   4. Denklem (1)'i kullanarak toplam bakteri yükünü mililitre başına koloni oluşturan birimler (CFU/mL) cinsinden ifade edin:
2. AR bakteri sayısının belirlenmesi
   1. 2.1.1-2.1.4 adımlarını izleyin. Bununla birlikte, R2A Agar, Modifiye plakalar yerine, sefotaksim (3 μg/mL), siprofloksasin (0.5 μg/mL), eritromisin (20 μg/mL), kanamisin (15 μg/mL) ve vankomisin (3 μg/mL) olmak üzere beş farklı antibiyotikle ayrı ayrı desteklenmiş R2A Agar, Modifiye plakalar kullanın.
   2. Adım 2.2.1'de belirtildiği gibi nihai antibiyotik konsantrasyonunu elde etmek için antibiyotikleri ayrı ayrı 20 mL steril erimiş R2A Agar, Modifiye (erimiş R2A Agar'ın sıcaklığı ile, ≤40 °C'de Modifiye edilmiş) içeren tüplere ekleyin.
   3. Eşit karıştırma için döndürün ve agar katılaşmadan önce steril Petri plakalarına dökün. Deneyi iki kopya halinde gerçekleştirin.
   4. Yukarıdaki tüm plakaları 35 - 37 °C'de 48 saat inkübe edin (farklı bir ortam kullanılıyorsa sıcaklık ve inkübasyon süresi değişebilir).
   5. Kalite kontrol ve antibiyotiklerin etkinliğini kontrol etmek için, Escherichia coli ATCC 25922 ve Staphylococcus aureus ATCC 29213 suşlarının 100 μL bakteriyel süspansiyonlarını ilgili antibiyotik içeren R2A Agar, modifiye plakalarına yayın (aşılama için kullanılan taze kültürün yoğunluğunun optik yoğunluk olduğundan emin olun, OD = 600 nm'de 0.5).
   6. Adım 2.1.4'te açıklandığı gibi CFU/mL cinsinden antibiyotiğe dirençli bakteri sayısını belirleyin.

3. 16S ribozomal RNA (rRNA) gen dizilimi ile kültürlenebilir bakterilerin tanımlanması

1. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) için izolatlardan DNA şablonunun hazırlanması
   1. Steril bir kürdan kullanarak, bir Petri plakası üzerinde büyüyen izolatın tek, izole, saf bir kolonisini alın. Bakteri kolonisini steril bir mikrosantrifüj tüpünde 100 μL steril çift damıtılmış suda süspanse edin ve 10 dakika kaynatın.
   2. Kalıntıları peletlemek için süspansiyonu 2 dakika boyunca 10.000 × g'da santrifüjleyin ve süpernatanı ham DNA şablonu olarak kullanılmak üzere taze bir steril mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
2. 16S rRNA geninin V3 bölgesinin hedeflenen PCR amplifikasyonu ve dizilimi
   1. Tablo 1'de belirtildiği gibi, PCR amplifikasyonu için bir PCR tüpünde 40 μL reaksiyon karışımı hazırlayın.
      NOT: DNA hazırlığı, kontaminasyon olasılığını en aza indirirken bir buz bloğu üzerinde gerçekleştirilmelidir (reaktifleri tutarken eldiven giyin ve çalışma yüzeyini p etanol ile iyice temizleyin).
   2. Tüpü termal bloğa yerleştirin ve PCR termal döngüleyicide uygun programı çalıştırın. Standartlaştırılmış PCR döngü koşulları ve 16S rRNA genlerinin V3 bölgelerinin amplifikasyonu için primer bilgileri için Tablo 2'ye bakın.

Tablo 1: PCR mastermix bileşenleri. Çeşitli PCR reaktiflerinin reaksiyon karışımı bileşimi.

PCR reaktifleri	Hacim (μL)
2x Taq Ana Karışımı	20
İleri astar (10 pico mol)	1.5
Ters astar (10 pico mol)	1.5
Ham DNA şablonu	1.5
Steril moleküler biyoloji suyu	15.5
Toplam hacim	40

 

 

 

 

 

 

 

Tablo 2: 16S rRNA geninin amplifikasyonu için PCR döngüsü koşulları. 16S rRNA gen amplifikasyonu için gerekli PCR döngüsü koşulları gösterilmiştir. Adımlar, bir ilk denatürasyon adımını, ardından 35 denatürasyon, tavlama ve uzatma döngüsünü ve son bir uzatma adımını içerir.

Yön	Astar Sırası 5' – 3'	PCR koşulları	Hayır. döngü sayısı
İletmek	GGAGGCAGCAGTAAGGAAT	94 °C'de 10 dakika	1
		94 °C'de 30 saniye denatürasyon	35
		50 °C'de 30 saniye tavlama
		72 °C'de 40 sn uzatma
Ters	CTACCGGGGTATCTAATCC	72 °C'de 5 dakika boyunca son uzatma	1

Malzemeler