Bitki konakçılarının ve etkileşen bakterilerin moleküler tepkilerini incelemek için bir birlikte yetiştirme sistemi

Bu makalede

Özet

Kaynak: Nathoo, N., ve diğerleri. Bitki/Mikrop Moleküler Etkileşimlerinin ve Sinyallemenin Eşzamanlı ve Sistematik Analizi için Hidroponik Birlikte Yetiştirme Sistemi. J. Vis. Uzm. (2017).

Bu video, steril koşullar altında bitki-bakteri etkileşimlerini incelemek için hidroponik bir birlikte yetiştirme sistemini göstermektedir. Bitki fideleri steril, asidik bir büyüme ortamına aktarılır, inkübe edilir ve Agrobacterium ile aşılamadan önce kontaminasyon açısından incelenir. Aktive edilmiş bakteriler bitki köklerine bağlanır, T-DNA'yı bitki hücrelerine aktarır ve bakteri kolonizasyonunu artıran moleküler değişiklikleri teşvik eder.

Protokol

1. Topraksız Birlikte Yetiştirme Sistemi

Sıvı Murashige ve Skoog (MS) ortamını hazırlayın: 2.165 g/L MS bazal tuzları, 10 g/L sakaroz, 0.25 g/L 2-(N-morfolino)etansülfonik asit (MES) ve 59 mL/L B5 vitamin karışımı, pH 5.75.
Ortamı otoklavlayın. Steril kapaklı her bir steril silindirik cam veya şeffaf plastik tanka (kristalize kaplar, 100 x 80 mm2) 18 mL dökün.
NOT: Tankları ve kapakları alüminyum folyoya sararak ve otoklavlayarak ön sterilize edin.
Sterilize edilmiş bir akış başlığında, 10-14 günlük fidelerin bulunduğu her bir ağ karesini yarı katı ortamdan hidroponik silindirik bir tanka nazikçe aktarmak için steril forseps kullanın (Şekil 1d). Gözenekli cerrahi bant kullanarak kapakları tankların üzerine kapatın.
Fideleri tanktaki ağ üzerinde 72 saat boyunca 22-24 °C'de, 16 saatlik bir fotoperiyotla ve havalandırma için 50 rpm'de çalkalayarak yetiştirin (Şekil 1e).
NOT: Bu, bitkilerin mikroorganizmalarla aşılamadan (birlikte yetiştirme) önce hidroponik ortama uyum sağlamasına olanak tanır. Bu bekleme süresi aynı zamanda aşılamadan önce kazara mikrobiyal kontaminasyonun belirgin olmasına da izin verecektir.
1. Bir sonraki adıma kuluçka döneminin bitiminden bir gün önce başlayın.
Agrobacterium tumefaciens'i agrobacterium (AB) ortamında (%0.5 w/v maya ekstraktı, %0.5 w/v tripton, %0.5 w/v sakaroz, 50 mM MgSO₄, pH 7.0) 28 °C'de 28 °C'de gece boyunca çalkalayarak büyütün, kültür 600 nm'de (OD₆₀₀) 1.0'lık bir nihai optik yoğunluğa ulaşana kadar, bir spektrofotometre kullanılarak ölçüldüğü gibi, aşılanmamış AB ortamı boş olarak.
NOT: 1.0'lık bir OD₆₀₀ , yaklaşık 10⁹ hücre/mL'ye eşdeğerdir.
A. tumefaciens'i eşit hacimde %0,85 NaCl içinde üç kez yıkayın. Eşit hacimde steril çift damıtılmış suda yeniden süspanse edin.
Aşılamadan önce, kontaminasyon olmadığından emin olmak için fidelerin bulunduğu tankı dikkatlice inceleyin; Kirlenmemiş tanklardaki ortam berrak ve şeffaf olmalıdır.
1. Bulanık sıvı (kirlenme) içeren herhangi bir tankı atın ve tankların geri kalanını numaralandırın. Numaralandırılmış her tanktan az miktarda (20 μL) hidroponik ortam numunesi alın ve Luria suyu (LB) ile doldurulmuş bir petri kabına yerleştirin. Çanağı 28 °C'de inkübe edin.
Hemen, numaralandırılmış her hidroponik tanka 50 μL A. tumefaciens süspansiyonu (OD_600'den tahmin edilen yaklaşık 5 x 10⁷ hücre) ekleyin. Arabidopsis thaliana fidelerini ve A. tumefaciens'i 22-24 °C'de 16 saatlik bir fotoperiyotla ve 50 rpm'de çalkalayarak birlikte yetiştirin (Şekil 3f).
1. Adım 1.7.1'deki benekli LB plakasını inceleyin. Tankların sterilitesini doğrulamak için 12 ve 28 saatlik inkübasyondan sonra. Herhangi bir kontaminasyon varsa, daha sonraki sonraki analizler için ilgili numaralı tankı (bakterilerle aşılanmış) kullanmayın.
İstenirse, tanktan bir ortam numunesi çıkararak ve OD_600'ü boş olarak aşılanmamış bir kontrolden alınan ortamla bir spektrofotometre kullanarak ölçerek A. tumefaciens'in büyümesini düzenli aralıklarla izleyin (Şekil 2).
NOT: Bitki hastalığı belirtileri 7 gün sonra ortaya çıkmalıdır (Şekil 3).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 1: Topraksız Bitki-Mikrop Birlikte Yetiştirme Sistemi. Sol panel, hidroponik ortak yetiştirme sisteminin montajı ve işletilmesindeki altı temel adımı özetleyen bir akış şemasını temsil eder. Sağdaki panel, Arabidopsis-Agrobacterium etkile...