E. coli Sferoplastların Hazırlanması

Özet

Kaynak: Figueroa, D.M., et.al. Antimikrobiyal peptit lokalizasyonunu karakterize etmek için bakteriyel sferoplastların ve protoplastların üretimi ve görselleştirilmesi. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu video, önce filamentasyonu indüklemek için hücre bölünmesini inhibe ederek, ardından hücre duvarının enzimatik sindirimini izleyerek Escherichia coli sferoplastlarının üretimini göstermektedir. İşlem, mikroskobik gözlem için uygun sferoplast oluşumunu ve stabilitesini sağlamak için bir şelatlama maddesi, DNaz ve bir ozmotik stabilizatörün kontrollü eklenmesini içerir.

Protokol

1. Çözelti Hazırlama

1. 10.34 g Tris HCl ve 4.17 g Tris OH'yi 125 mL'lik bir şişede 50 mL dH₂O içinde çözerek 1 M Tris-Cl, pH 7.8 hazırlayın. 0,2 μm membranlı 25 mm'lik bir şırınga filtresinden süzerek sterilize edin ve oda sıcaklığında konik bir tüpte saklayın.
2. 0.10 g MgCl _{2 (}95.2 g / mol) ve 11.98 g sükroz (342.3 g / mol) 125 mL'lik bir şişede 25 mL dH₂O içinde çözülerek çözelti A (20 mM MgCl 2 , 0.7 M sükroz, 10 mM Tris-Cl, pH 7.8) hazırlayın. 500 μL 1 M Tris-Cl (pH 7.8) ekleyin ve hacmi 50 mL'ye ayarlayın. 0,2 μm membranlı 25 mm'lik bir şırınga filtresinden süzerek sterilize edin ve oda sıcaklığında konik bir tüpte saklayın.
3. 0.05 g MgCl _{2 (}95.2 g / mol) ve 13.69 g sükroz (342.3 g / mol) 125 mL'lik bir şişede 25 mL dH₂O içinde çözülerek çözelti B'yi (10 mM MgCl 2 , 0.8 M sükroz, 10 mM Tris-Cl, pH 7.8) hazırlayın. 500 μL 1 M Tris-Cl (pH 7.8) ekleyin ve hacmi 50 mL'ye ayarlayın. 0,2 μm membranlı 25 mm'lik bir şırınga filtresinden süzerek sterilize edin ve oda sıcaklığında konik bir tüpte saklayın.
4. 13.69 g sükrozu (342.3 g/mol) 50 mL dH₂O içinde 125 mL'lik bir şişede çözerek 0.8 M sükroz hazırlayın. 0,2 μm membranlı 25 mm'lik bir şırınga filtresinden süzerek sterilize edin ve oda sıcaklığında konik bir tüpte saklayın.
5. 50 mL'lik bir şişede 0.015 g DNase I'i 3 mL dH₂O içinde çözerek 5 mg / mL deoksiribonükleaz I (DNase I) hazırlayın. 0,2 μm membranlı 25 mm'lik bir şırınga filtresinden süzerek sterilize edin. Alikot çözeltisini mikrofüj tüplerine koyun ve -20 °C'de saklayın.
6. 0.698 g EDTA disodyum dehidratı (372.2 g/mol) 125 mL'lik bir şişede 15 mL dH₂O içinde çözerek 0.125 M etilendiamintetraasetik asit (EDTA), pH 8.0 hazırlayın. 0,2 μm membranlı 25 mm'lik bir şırınga filtresinden süzerek sterilize edin ve oda sıcaklığında konik bir tüpte saklayın.
7. 125 mL'lik bir şişede 50 mL_dH2O içinde 0.03 g sefaleksin hidratı (365.404 g / mol) çözerek 600 μg / mL sefaleksin hazırlayın. 0,2 μm membranlı 25 mm'lik bir şırınga filtresinden süzerek sterilize edin ve 4 °C'de konik bir tüpte saklayın.
8. 50 mL'lik bir şişede 0.015 g lizozimi 3 mL dH₂O içinde çözerek 5 mg/mL lizozim hazırlayın. 0,2 μm membranlı 25 mm'lik bir şırınga filtresinden süzerek sterilize edin. Alikot çözeltisini mikrofüj tüplerine koyun ve -20 °C'de saklayın.
9. 30 g TSB'yi 1 L dH₂O içinde 2 L'lik bir şişede çözerek %3 w/v Triptikaz Soya Suyu (TSB) hazırlayın. Çözeltiyi, E. coli sferoplastlarının hazırlanmasında kullanılmak üzere 25 mL veya 100 mL TSB içeren şişelere ayırın. Sıvı ortamı sterilize etmek için otoklav şişeleri. Steril TSB, oda sıcaklığında veya 4 °C'de saklanabilir.

2. Gece Kültürünün Hazırlanması

NOT: Uygun steril teknikleri kullanarak 2-3. bölümleri gerçekleştirin. İstenirse, bir bakteri suşu, potansiyel kontaminasyonu azaltmak için antibiyotik direnci için bir plazmit içerebilir. Antibiyotik direnci olan bir suş kullanıyorsanız, gerekli antibiyotikleri 2.1 ve 3.1-3.2 adımlarında ekleyin.

1. Steril bir pipet ucu kullanarak tek bir bakteri kolonisi toplayarak ve 2-3 mL %3 w/v TSB içeren 14 mL'lik bir kültür tüpüne yerleştirerek bir gece kültürü hazırlayın. 16-21 saat çalkalayarak 37 °C'de inkübe edin.

3. Gram-negatif E. coli Sferoplastların Hazırlanması

1. 250 mL'lik bir şişede, gece kültürünü 1:100 25 mL hacimde %3 w/v TSB'de seyreltin ve bakteri çözeltisini 37 °C'de inkübe edin ve çözelti 600 nm'de 0,5-0,8'lik bir optik yoğunluğa ulaşana kadar yaklaşık 2,5 saat çalkalayın. Bir spektrofotometre kullanarak optik yoğunluğu ölçün.
2. 250 mL'lik bir şişede, bu kültürü 30 mL %3 w/v TSB'de 1:10 oranında seyreltin ve 37 °C'de inkübe edin, 60 μg/mL sefaleksin (347.4 g/mol) varlığında 2.5 saat çalkalayarak yaklaşık 50-150 μm uzunluğunda tek hücreli filamentler üretin, ışık mikroskobu kullanılarak 1.000X büyütme altında gözlemlenebilir (Şekil 1B).
3. Bakteri çözeltisini 1.500 x g, 4 °C'de 4 dakika santrifüjleyerek filamentleri hasat edin. Peleti ayırarak süpernatanı boşaltın ve atın.
4. Filamentleri nazikçe 1 mL 0,8 M sakkaroz ekleyerek yıkayın, peleti rahatsız etmemeye dikkat edin. 1 dakika inkübe edin ve ardından peleti bozmadan süpernatanı atın.
5. Pelete 150 μL 1 M Tris-Cl (pH 7.8), 120 μL 5 mg/mL lizozim, 30 μL 5 mg/mL DNase I ve 120 μL 0.125 M EDTA ekleyin ve çözeltiyi oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
6. Çözeltiyi elle hafifçe döndürürken bir mikropipet kullanarak 3.5'te hazırlanan çözeltiye 1 dakika boyunca kademeli olarak 1 mL çözelti A ekleyin. Çözeltiyi oda sıcaklığında 4 dakika inkübe edin.
7. 7 mL 4 °C çözelti B'yi iki adet 15 mL'lik konik tüpe koyun. Bu iki tüpün her birine 3.6'da hazırlanan çözeltiden eşit miktarda ekleyin. Çözeltiyi 1.500 x g, 4 °C'de 4 dakika santrifüjleyin.
8. Serolojik bir pipet kullanarak, peleti bozmadan 1-2 mL süpernatant hariç tümünü dikkatlice çıkarın. Bir P1000 mikropipet kullanarak yukarı ve aşağı doğru hafifçe pipetleyerek peleti yeniden süspanse edin. Numuneyi bir ışık mikroskobu kullanarak 1.000X büyütmede gözlemleyerek sferoplast oluşumunu görsel olarak kontrol edin (Şekil 1C).
9. Sferoplastları -20 °C'de bir haftaya kadar veya 3 donma-çözülme döngüsünden geçene kadar saklayın.

Sonuçlar

Şekil 1: E. coli'nin temsili görüntüleri. (A) E. coli bakterileri (B) E. coli yılanı ve (C) E. coli sferoplast. Görüntüler 100X büyü...

Malzemeler